5-1. ЧАШЕЧНЫЕ АГАРОВЫЕ МЕТОДЫ

Для культивирования микроорганизмов используют агаризованные питательные среды: соево-казеиновый агар или среду N 1 сухую для контроля микробной загрязненности - для выращивания бактерий, агар Сабуро с глюкозой или среду N 2 сухую для контроля микробной загрязненности - для выращивания дрожжевых и плесневых грибов.

Для каждого разведения испытуемого образца используют не менее 2 чашек Петри с определенной средой.

5-1-1. Глубинный метод. В стерильную чашку Петри диаметром 90 мм вносят 1 мл разведения испытуемого образца, приготовленного для анализа. Добавляют 15 - 20 мл расплавленной и охлажденной до температуры (42,5 +/- 2,5) °C стерильной агаризованной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают до 20 - 25 мл. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют посевы.

5-1-2. Двухслойный метод. Расплавленную агаризованную стерильную питательную среду вносят в количестве 15 - 20 мл в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашки Петри количество среды соответственно увеличивают. Поверхность агара в чашке подсушивают.

В пробирку с 4 мл соответствующей расплавленной и охлажденной до температуры (42,5 +/- 2,5) °C питательной среды вносят 1 мл разведения испытуемого образца, приготовленного для анализа, быстро перемешивают содержимое пробирки. Затем содержимое пробирки выливают на поверхность застывшего и подсушенного агара в чашке Петри, равномерно распределяя верхний слой среды вращательными движениями. После застывания чашку переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

5-1-3. Поверхностный метод. Расплавленные и охлажденные до температуры (42,5 +/- 2,5) °C стерильные питательные среды вносят в количестве 15 - 20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. Поверхность агара в чашках подсушивают в термостате или ламинарном шкафу.

Разведение испытуемого образца, приготовленного для анализа, наносят стерильной пипеткой на агар в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды.

Чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

5-1-4. Модифицированный глубинный метод. Разведение испытуемого образца, приготовленного для анализа, в количестве 1,0 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 7 - 10 мл расплавленной и охлажденной до температуры (42,5 +/- 2,5) °C питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют.

5-1-5. Учет и интерпретация результатов, полученных чашечными агаровыми методами. Результат фиксируют через 5 сут.

Для получения достоверных результатов отбирают чашки, в которых число колоний бактерий не превышает 250, а колоний грибов - 50. Если при учете результатов 2 последующих разведений число колоний на чашках находится в указанных выше пределах, рассчитывают результаты из меньшего разведения.

Если в среднем на чашках выросло более 250 колоний бактерий или более 50 колоний грибов, делают ряд дальнейших последовательных разведений испытуемого образца, выбирая приемлемое для посева значение.

Если на соево-казеиновом агаре (среде N 1) дополнительно обнаружены колонии грибов, то их суммируют с числом бактерий и определяют общее число аэробных микроорганизмов, которое установлено для каждой категории ЛС.

Если на среде Сабуро (среда N 2) дополнительно обнаружены колонии бактерий, то их суммируют с числом грибов и определяют общее число дрожжевых и плесневых грибов, которое установлено для каждой категории ЛС.

Если на питательной среде отсутствует рост микроорганизмов, результаты отмечают в протоколе испытания следующим образом: при посеве испытуемого образца в разведении 1:10 - "В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 10 микроорганизмов (или грибов)"; при посеве испытуемого образца в разведении 1:100 - "В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 100 микроорганизмов (или грибов)" и т.д.

Количество микроорганизмов (N) в 1 г или в 1 мл рассчитывают по формуле:

,

где: c - количество колоний на всех чашках Петри;

n - число чашек Петри;

d - коэффициент разведения испытуемого образца;

v - объем образца, высеваемый на чашку (мл).

Пример. При посеве 1,0 мл испытуемого образца из разведения 10^-2 на 2 чашках выросло 168 и 215 колоний:

.

Полученный результат округляют до 2 значащих цифр - 19000 и записывают как 1,9·10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ).

Варианты чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный и глубинный модифицированный) можно использовать при испытании различных лекарственных форм, независимо от уровня микробной загрязненности. Поверхностный агаровый метод предпочтительнее использовать при испытании ЛС с высоким уровнем микробной контаминации. Для сокращения сроков получения результатов количественного определения бактерий и грибов, колонии которых склонны к сливному росту, используют модифицированный агаровый метод посева.