ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В изоэлектрической точке молекула белка не заряжена и не может передвигаться в матрице геля под действием электрического поля. Ее перемещение, однако, может происходить в результате диффузии. Градиент pH вынуждает белок оставаться в изоэлектрическом состоянии, концентрируя данное вещество. Такое концентрирование называется "фокусированием". Увеличение приложенного напряжения или уменьшение количества нанесенного вещества улучшает разделение полос. Величина приложенного напряжения ограничена выделяющейся теплотой, которая должна быть рассеяна. Использование тонких слоев геля, а также пластин с эффективным охлаждением, контролируемых термостатирующим устройством, предотвращает возгорание геля и в тоже время обеспечивает точное фокусирование. Разделение оценивают по минимальной разности pI , которая необходима для разделения двух соседних полос:

,

где: D - коэффициент диффузии белка;

- градиент pH;

E - напряженность электрического поля, в вольтах на сантиметр;

- изменение подвижности вещества при изменении pH в диапазоне, близком к pI.

Поскольку D и для определенного белка не могут быть изменены, улучшить разделение можно при использовании более узкого диапазона pH либо при увеличении напряженности электрического поля.

Разрешение между полосами белков в случае использования ИЭФ-геля, содержащего ведущие амфолиты, достаточно хорошее. Улучшить разрешение можно при использовании фиксированных градиентов pH, для создания которых применяются буферные вещества, аналогичные ведущим электролитам, сополимеризованные с матрицей геля. При использовании геля, содержащего ведущие электролиты, могут быть разделены белки, значения pI которых отличаются в пределах 0,02 единиц pH, в то время как фиксированные градиенты pH позволяют разделить белки, изоэлектрические точки которых различаются приблизительно на 0,001 pH.