МЕТОДИКА

Форму разбирают на составные части и, используя полиэфирную пленку, переносят гель на охлажденную подложку, увлажненную несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая образования воздушных пузырьков. Готовят испытуемые растворы и растворы сравнения, в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье. Для нанесения образца на поверхность геля помещают полоски бумаги размером приблизительно 10 мм x 5 мм и пропитывают каждую из них указанным количеством испытуемого раствора и раствора сравнения. Также наносят указанное в частной фармакопейной статье количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек, служащих в качестве маркеров pH для калибровки геля. В некоторых протоколах вместо импрегнированных бумажных полосок используют гель, который имеет лунки, предназначенные для помещения раствора образца. Отрезают 2 полоски бумаги длиной, соответствующей длине геля, и пропитывают их растворами электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода (составы анодного и катодного растворов приводятся в частной фармакопейной статье). Эти бумажные фитильки помещают на каждую сторону геля на расстоянии нескольких миллиметров от его границы. Устанавливают крышку так, чтобы электроды контактировали с полосками бумаги (соответственно, анодным и катодным полями). Выполняют изоэлектрическое фокусирование, используя параметры, электрического поля, указанные в частной фармакопейной статье. Когда миграция смеси стандартных белков стабилизируется, отключают источник питания. С помощью пинцета удаляют полоски, предназначенные для нанесения образца, и 2 электродных фитилька. Погружают гель в фиксирующий раствор для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле P. Выдерживают, осторожно встряхивая, при комнатной температуре в течение 30 мин. Сливают раствор и прибавляют 200 мл обесцвечивающего раствора P. Выдерживают при перемешивании в течение 1 ч. Высушивают гель, прибавляют Кумасси красящий раствор P. Выдерживают в течение 30 мин и обесцвечивают гель путем пассивной диффузии обесцвечивающего раствора P до тех пор, пока на чистом фоне не будут хорошо видны полосы. Положение и интенсивность полос на электрофореграмме, отмечают в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье.