5-3. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ

Ниже детально описаны наиболее широко применяемые методы окрашивания белков красителем Кумасси и серебром. Коммерчески доступны также и другие красители, методы обнаружения и наборы. Например, флуоресцентные красители используются совместно с флуоресцентным устройством для получения изображений и часто обеспечивают линейную зависимость аналитического сигнала в широком диапазоне концентраций белка, часто в пределах нескольких порядков в зависимости от природы белка.

Окрашивание красителем Кумасси позволяет определять от 1 мкг до 10 мкг белков в одной полосе. Окрашивание серебром - более чувствительный метод окрашивания белков, при этом могут быть обнаружены полосы, содержащие от 10 нг до 100 нг белка. Эти цифры считаются реально достижимыми для данной окраски гелей. Иногда в литературе указывается чувствительность окрашивания серебром на 1 или 2 порядка выше.

Окрашивание красителем Кумасси обеспечивает более линейный сигнал, чем окрашивание серебром; тем не менее, сигнал и диапазон зависят от природы белка и времени проведения электрофоретического разделения. Воспроизводимость при окрашивании красителем Кумасси и серебром может уменьшаться, если окрашивание прекращают из субъективных соображений, то есть в момент, когда оно кажется достаточным. Очень важно использовать динамические диапазоны стандартных белков, так как они помогают оценить чувствительность и линейность при проведении испытания. Все стадии окрашивания гелем выполняются в одноразовых перчатках, при комнатной температуре, при осторожном перемешивании (например, на платформе орбитального шейкера) и с использованием любого удобного контейнера.

Окрашивание красителем Кумасси. Гель погружают в большой объем окрашивающего раствора Кумасси P, выдерживают в течение не менее 1 ч. Затем сливают окрашивающий раствор.

Гель обесцвечивают большим объемом отмывающего раствора P. Отмывающий раствор меняют несколько раз до четкого проявления белковых полос на прозрачном фоне. Чем тщательнее отмывают гель, тем меньшее количество белков можно найти этим методом. Обесцвечивание можно ускорить добавлением в отмывающий раствор P нескольких граммов анионообменной смолы или маленького кусочка пористого материала.

ПРИМЕЧАНИЕ. Кислотно-спиртовые растворы, используемые в указанной методике, не позволяют полностью фиксировать белки в геле. Это может привести к потерям некоторых низкомолекулярных белков в процессе окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в смеси трихлоруксусная кислота P - метанол P - вода P (1:4:5, об/об/об) в течение 1 ч перед погружением геля в окрашивающий раствор Кумасси P.

Окрашивание серебром. Гель погружают в большой объем фиксирующего раствора P и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию фиксирующего раствора, выдерживают в течение не менее 1 ч или, если возможно, в течение ночи. Затем фиксирующий раствор сливают и гель промывают большим объемом воды P в течение 1 ч. Далее гель выдерживают в 1% растворе глутарового альдегида P (об/об) в течение 15 мин, дважды промывают большим объемом воды P, каждый раз в течение 15 мин, помещают в свежеприготовленный реактив серебра нитрата P и выдерживают в течение 15 мин в темном месте. Затем трижды промывают большим объемом воды P, каждый раз в течение 5 мин. Гель выдерживают в растворе проявителя P в течение около 1 мин до достаточного окрашивания. Проявление останавливают, помещая гель в блокирующий раствор P на 15 мин. Ополаскивают гель водой P.