МЕТОД 3

Данный метод (обычно называемый методом количественного определения Бредфорда) основан на сдвиге максимума поглощения, обусловленного связыванием белка с красителем кислотным синим 90, от длины волны 470 нм до 595 нм. Краситель кислотный синий 90 наиболее активно связывает в белке остатки аргинина и лизина, что может приводить к погрешности при количественном определении различных белков. Белок, используемый в качестве стандартного образца, должен быть таким же, как и испытуемый белок. Мешающих веществ относительно немного, однако необходимо избегать присутствия в испытуемом образце детергентов и амфолитов. Сильнощелочные образцы могут взаимодействовать с кислотным реактивом.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную P.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого образца в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье, с концентрацией белка в пределах интервала концентраций калибровочной кривой.

Растворы сравнения. Готовят раствор соответствующего стандартного образца белка в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье. Порции полученного раствора разводят тем же буферном раствором для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале от 0,1 мкг/мл до 1 мкг/мл.

Контрольный раствор. Буферный раствор, применяемый для приготовления испытуемого раствора и растворов сравнения.

Кислотного синего 90 реактив. 0,10 г кислотного синего 90 P растворяют в 50 мл 96% этанола P. Прибавляют 100 мл фосфорный кислоты P, доводят объем раствора дистиллированной водой P до 1000 мл и перемешивают. Фильтруют раствор и хранят в контейнере из темного стекла при комнатной температуре. При хранении выпадает осадок красителя, поэтому перед использованием реактив необходимо фильтровать.

Методика. К 0,100 мл каждого раствора сравнения, испытуемого раствора и контрольного раствора прибавляют по 5 мл кислотного синего 90 реактива, перемешивают переворачивая. Избегают образования пены, приводящей к ухудшению воспроизводимости. Измеряют оптические плотности (2.1.2.24) растворов сравнения и испытуемого раствора при длине волны 595 нм, используя контрольный раствор в качестве компенсационного раствора. Не допускается использование кварцевых (кремниевых) спектрофотометрических кювет, вследствие связывания красителя с этими материалами.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, однако, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочной кривой, небольшой, она приближается к линейной. Строят график зависимости оптических плотностей растворов сравнения от концентраций белка и, используя линейную регрессию, строят калибровочную кривую. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.