МЕТОД 6

Данный флуориметрический метод основан на дериватизации белка о-фталевым альдегидом, который взаимодействует с первичными аминогруппами белка (N-концевая аминокислота и эпсилон-аминогруппа остатков лизина). Чувствительность количественного определения может быть повышена гидролизом белка перед прибавлением о-фталевого альдегида. Гидролиз делает альфа-аминогруппы аминокислот, входящих в структуру белка, доступными для реакции с реактивом фталевого альдегида. Для данного метода требуется очень небольшое количество белка. Первичные амины, например, трис(гидроксиметил)-аминометан и аминокислотные буферные растворы взаимодействуют с фталевым альдегидом, поэтому их необходимо избегать или удалять. Аммиак при высоких концентрациях взаимодействует с фталевым альдегидом. Флуоресценция, полученная при взаимодействии амина с фталевым альдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных процедур для стандартизации данного метода может повысить правильность и прецизионность.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную P.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого образца в растворе 9 г/л натрия хлорида P с концентрацией белка в пределах концентраций растворов сравнения. Перед прибавлением реактива фталевого альдегида pH раствора доводят до значения от 8 до 10,5.

Растворы сравнения. Готовят раствор соответствующего стандартного образца белка в растворе 9 г/л натрия хлорида P. Порции полученного раствора разводят раствором 9 г/л натрия хлорида P для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл. Перед прибавлением реактива фталевого альдегида pH раствора доводят до значения от 8 до 10,5.

Контрольный раствор. Раствор 9 г/л натрия хлорида P.

Боратный буферный раствор. 61,83 г борной кислоты P растворяют в воде дистиллированной P, pH раствора корректируют раствором калия гидроксида P до значения 10,4 и доводят водой дистиллированной P до объема 1000 мл, перемешивают.

Фталевого альдегида основной раствор, 1,20 г фталевого альдегида P растворяют в 1,5 мл метанола P, прибавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Добавляют 0,6 мл раствора 300 г/л макрогола 23 лаурилового эфира P и перемешивают. Хранят при комнатной температуре и используют в течение трех недель.

Фталевого альдегида реактив. К 5 мл основного раствора фталевого альдегида прибавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола P. Раствор готовят не менее чем за 30 мин перед использованием. Используют в течение 24 ч.

Методика. Смешивают по 10 мкл испытуемого раствора и каждого раствора сравнения с 0,1 мл реактива фталевого альдегида, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляют по 3 мл 0,5 M раствора натрия гидроксида и перемешивают. Определяют флуоресценцию (2.1.2.20) растворов сравнения и испытуемого раствора при длине волны возбуждающего излучения 340 нм и длине волны испускаемого излучения от 440 нм до 455 нм. Измеряют интенсивность флуоресценции полученных растворов только один раз, поскольку излучение снижает интенсивность флуоресценции.

Расчеты. Зависимость флуоресценции от концентрации белка является линейной. Строят график зависимости интенсивности флуоресценции растворов сравнения от концентраций белка и, используя линейную регрессию, строят калибровочную кривую. На основании калибровочной кривой и интенсивности флуоресценции испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.