МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-N-ГИДРОКСИСУКЦИНИМИДИЛКАРБАМАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. АХК реагирует с аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных производных мочевины (АХК-аминокислот), которые легко поддаются анализу методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны возбуждающего света 250 нм и при длине волны излучаемого света 395 нм допускает прямой ввод реакционной смеси без каких-либо существенных поправок на основной флуоресцирующий побочный продукт - 6-аминохинолин. Избыток реактива быстро гидролизуется (t_1/2 < 15 с) с образованием 6-аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин дальнейшее образование производных не происходит.

Площади пиков для АКХ-аминокислот, по существу, не изменяются, по меньшей мере, в течение 1 недели хранения растворов при комнатной температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем достаточной стабильностью для проведения круглосуточного автоматического хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты, кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.

Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 2,5 - 500 мкмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 30 нг.