Жидкостная хроматография: градиентное элюирование

Регулирование условий хроматографирования при градиентном элюировании требует большей осторожности, чем при изократическом элюировании.

Состав подвижной фазы/градиентного элюирования: незначительное корректирование состава подвижной фазы и системы градиента допустимо при следующих условиях:

- выполняются требования пригодности хроматографической системы;

- основной(ые) пик(и) элюируется в пределах +/- 15% от указанного(ых) времени(ен) удерживания;

- элюирующая способность конечного состава подвижной фазы должна быть не ниже, чем у состава, указанного в частной фармакопейной статье.

Если соответствие требованиям пригодности хроматографической системы не может быть достигнуто, предпочтительным зачастую является оценка объема задержки или замена хроматографической колонки.

Объем задержки. Конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, время удерживания или относительное удерживание, описанные в методике, что может произойти из-за избыточного объема задержки. В частных фармакопейных статьях обычно включают изократическую стадию до начала программы градиентного элюирования, обеспечивая адаптацию к временным точкам градиента с учетом разницы в объеме задержки между системой, использованной при разработке частной фармакопейной статьи, и фактически используемой системы. Адаптация продолжительности изократической стадии в зависимости от используемого аналитического оборудования входит в ответственность пользователя. Если в частной фармакопейной статье приведен объем задержки, установленный при ее разработке, то временные точки (t, мин), указанные в таблице градиента, могут быть заменены на адаптированные временные точки (t_c, мин), рассчитанные по формуле:

,

где: D - объем задержки в миллилитрах;

D₀ - объем задержки, использованный при разработке методики, в миллилитрах;

F - скорость подвижной фазы в миллилитрах в минуту.

Изократическая стадия, введенная с данной целью, может быть исключена при наличии данных по валидации методики, применяемой без указанной стадии.

pH водного компонента подвижной фазы: корректирование не допускается.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: корректирование не допускается.

Скорость подвижной фазы: корректирование допускается при изменении размеров колонки (см. формулу ниже).

Характеристики колонки:

Неподвижная фаза:

- не допускается изменение заместителей неподвижной фазы (т.е. не допускается замена C₁₈ на C₈;

- размер частиц: корректирование не допускается.

Размер колонки:

- длина: +/- 70%;

- внутренний диаметр: +/- 25%.

При изменении размера колонки скорость подвижной фазы может корректироваться, при необходимости, по формуле:

,

где: F₁ - скорость подвижной фазы, указанная в частной фармакопейной статье, в миллилитрах в минуту;

F₂ - скорректированная скорость подвижной фазы в миллилитрах в минуту;

l₁ - длина колонки, указанная в частной фармакопейной статье в миллиметрах;

l₂ - длина используемой колонки в миллиметрах;

d₁ - внутренний диаметр колонки, указанный в частной фармакопейной статье в миллиметрах;

d₂ - внутренний диаметр используемой колонки в миллиметрах.

Температура: +/- 5 °C в случае контролируемой рабочей температуры при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Длина волны детектора: корректирование не допускается.

Объем вводимой пробы: может быть уменьшен при условии, что используемое детектирование и повторяемость пика(ов) остаются удовлетворительными; увеличение не допускается.