ПРИНЦИП

Определение общей ДНК состоит из четырех этапов:

- денатурация и образование комплексов: при нагревании образца ДНК денатурируется в одноцепочечную ДНК; денатурированную ДНК смешивают с реактивом, который содержит белок, конъюгированный со стрептавидином (связывающим одноцепочечную ДНК), и моноклональное антитело к ДНК, конъюгированное с уреазой. ДНК-связывающий белок и моноклональное антитело специфичны для одноцепочечной ДНК, но не специфичны для двуцепочечной. Наличие стрептавидина в жидкой фазе способствует образованию комплекса с одноцепочечной ДНК из образца;

- фильтрация: комплекс фильтруют через биотинилированную нитроцеллюлозную мембрану. Биотин в мембране захватывает комплексы, связываясь со стрептавидином. Мембрану промывают для удаления любых несвязанных реактивов. Для исключения неспецифического связывания используют нитроцеллюлозную мембрану, покрытую альбумином;

- детектирование: мембрану помещают в планшетный спектрофотометр, содержащий раствор мочевины, реагирующий с уреазой в комплексе ДНК с образованием аммиака. Соответствующее изменение pH, которое измеряют потенциометрическим датчиком (в микровольт в секунду), прямо пропорционально количеству ДНК в образце;

- анализ: исходные данные для образца и стандартной кривой обрабатывают с использованием соответствующего программного обеспечения для определения остаточного содержания ДНК клетки-хозяина в образце.

Все образцы и отрицательные контроли испытывают с добавками и без добавок. Раствор добавки (1000 пг/мл) готовят путем разбавления концентрированного стандартного раствора (ДНК тимуса теленка) с концентрацией 5000 пг/мл.