ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Для аминокислотного анализа белков и пептидов необходимо проводить гидролиз. Лабораторная посуда, используемая для проведения гидролиза, должна быть очень чистой. Опудривающий порошок для перчаток, а также отпечатки пальцев на посуде, в которой проводится гидролиз, могут привести к загрязнению. Для очистки стеклянных пробирок для проведения гидролиза используют кипячение в течение 1 ч в 1 M растворе хлороводородной кислоты или замачивание в концентрированной азотной кислоте или в смеси из равных объемов концентрированных хлороводородной и азотной кислот. Чистые пробирки, используемые для гидролиза, промывают водой высокоочищенной, затем ополаскивают метанолом для хроматографии, сушат в сушильном шкафу в течение ночи и хранят закрытыми вплоть до использования. Для удаления загрязнения из пробирок, которые используются для гидролиза, также можно использовать прокаливание чистой стеклянной посуды при температуре 500 °C в течение 4 ч. Допускается использование соответствующих одноразовых лабораторных принадлежностей.

Кислотный гидролиз является наиболее часто используемым методом для расщепления белка перед проведением аминокислотного анализа. Метод кислотного гидролиза может повлиять на отклонение результатов анализа из-за полного или частичного разрушения некоторых аминокислот: триптофан разрушается, серин и треонин частично разрушаются, метионин может подвергаться окислению, а цистеин обычно определяется как цистин (но открываемость цистина обычно низкая вследствие частичного разрушения или восстановления до цистеина). Применение соответствующего вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргона) в пространство реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. В пептидных связях, образованных изолейцином и валином, амидные группы Иле-Иле, Вал-Вал, Иле-Вал и Вал-Иле гидролизуются частично; аспарагин и глутамин дезамидируются с образованием соответственно аспарагиновой и глутаминовой кислот. Потеря триптофана, аспарагина и глутамина в ходе кислотного гидролиза ограничивает количественное определение до 17 аминокислот. Некоторые из описанных ниже методов кислотного гидролиза используются для решения этих задач. Некоторые методы гидролиза (например, методы 4 - 11) могут приводить к превращениям в другие аминокислоты. Поэтому преимущества использования конкретной методики оцениваются относительно задач, решаемых с ее помощью, и всесторонне изучаются перед выбором методики, отличающейся от обычного кислотного гидролиза.

Для определения исходной концентрации аминокислот, которые частично разрушаются или медленно отщепляются, часто используют исследование гидролиза во времени (аминокислотный анализ при кислотном гидролизе в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч). Путем построения графика зависимости найденной концентрации лабильных аминокислот (например, серина и треонина) от времени гидролиза и экстраполяции полученной кривой к началу координат определяют исходную концентрацию этих аминокислот. Концентрацию остатков аминокислот, которые медленно отщепляются (например, изолейцин и валин), принимают равной высоте плато на полученном графике зависимости концентрации остатков от времени гидролиза. Если гидролиз будет протекать слишком долго, концентрация остатков аминокислот в образце начнет уменьшаться, что указывает на их разрушение при данных условиях гидролиза.

Приемлемой альтернативой исследованию гидролиза во времени является проведение гидролиза стандарта аминокислот с известными концентрациями в таких же условиях, что и для испытуемого образца. Аминокислоты в свободном состоянии не могут в полной мере отражать скорость деструкции при гидролизолабильных аминокислот, входящих в состав пептидов или белков. Это особенно справедливо для медленно расщепляющихся пептидных связей (например, связи Иле-Вал). Однако данная методика позволяет аналитику учесть лишь некоторую часть разрушающихся аминокислот. Возможно применение кислотного гидролиза с использованием микроволнового излучения, который отличается быстротой, но требует специального оборудования, а также специальных мер предосторожности. Оптимальные условия гидролиза с использованием микроволнового излучения должны быть установлены для каждого отдельного белкового/протеинового образца. Микроволновый гидролиз обычно протекает в течение нескольких минут, но отклонение даже в одну минуту может привести к неудовлетворительным результатам (например, неполный гидролиз или разрушение лабильных аминокислот). Полный протеолиз с применением смеси протеаз может быть слишком сложным, он требует надлежащего контроля и обычно более подходит для пептидов, чем для белков.

Для определения оптимальных условий в ходе первоначального анализа белка неизвестного состава проводятся эксперименты с различными временами гидролиза и при разных температурных режимах.