2.3.19.6. БЕЛКИ-НОСИТЕЛИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИН ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Использование альтернативных белков-носителей, методов производства и испытаний приемлемо при условии, что они были разрешены уполномоченным органом.

Бактериальные полисахариды не способны индуцировать зависимый от T-клеток иммунный ответ B-клеток, необходимый для ответной реакции иммунологической памяти, и, как правило, имеют слабую иммуногенность у детей в возрасте до двух лет. Данное ограничение преодолевается конъюгированием полисахаридов с белками-носителями. Высоко иммуногенные белки-носители, конъюгированные с бактериальными полисахаридами, увеличивают способность полисахаридов вызывать защитную ответную реакцию у иммунизированных.

В качестве белков-носителей в полисахаридных вакцинах используют: анатоксины, нетоксичные мутантные токсины, поверхностные или другие мембранные белки, выделенные из микроорганизмов. Микроорганизмы, используемые при их производстве, могут иметь генетически модифицированное происхождение.

Метод производства, используемый для белков-носителей, должен обеспечивать постоянство получаемых серий белков-носителей, подходящих для конъюгации с полисахаридными антигенами.

Перед конъюгацией с полисахаридом могут быть установлены соответствующие критерии приемлемости низкой бионагрузки. Обязательным условием является фильтрация белка-носителя перед хранением через фильтр, задерживающий бактерии, и принятие соответствующих мер для предотвращения контаминации и роста микроорганизмов во время хранения.

Производство белков-носителей основывается на системе посевного материала. Должно быть подтверждено отсутствие контаминации посевного материала с использованием подходящего метода с соответствующей чувствительностью. При необходимости культуру микроорганизмов инактивируют, белки-носители очищают подходящим методом.

Белки-носители характеризуют одним или более подходящими методами (например, электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом, изоэлектрическое фокусирование, высокоэффективная жидкостная хроматография, эксклюзионная хроматография с детекцией многоуглового лазерного рассеивания, аминокислотный анализ, аминокислотное секвенирование, круговой дихроизм, флуоресцентная спектрометрия, пептидное картирование, масс-спектрометрия). Чистоту белков подтверждают подходящим методом. Для подтверждения, что продукт не содержит специфических токсинов, где это применимо, выполняют соответствующее испытания в процессе валидации или рутинного анализа. В случае необходимости этапа очистки проводят мониторинг удаления отдельных производственных примесей для подтверждения постоянства процесса очистки. В случае использования рекомбинантных белков-носителей выполняют испытания, как минимум, для следующих примесей:

- остаточные белки клетки-хозяина, включая белковые остатки экспрессионного вектора;

- остаточная ДНК клетки-хозяина.

Для приготовления конъюгатов могут быть использованы только белки-носители, выдерживающие следующие испытания.

Идентификация. Для подтверждения подлинности белка-носителя используют подходящий метод.

pH (2.1.2.3). Если применимо, проводят испытание белка-носителя до конъюгирования на соответствие пределам, одобренным уполномоченным органом.

Содержание белка. Содержание белка-носителя определяют с использованием подходящего метода на соответствие пределам, одобренным уполномоченным органом.

Бактериальные эндотоксины (2.1.6.8). Содержание бактериальных эндотоксинов определяют на соответствие пределам, одобренным уполномоченным органом.

Кроме того, к белкам-носителям применяют следующие требования.

Дифтерийный анатоксин. Дифтерийный анатоксин, произведенный как описано в частной фармакопейной статье на вакцину для профилактики дифтерии адсорбированную, должен выдерживать требования указанной частной фармакопейной статьи для нерасфасованного очищенного анатоксина, за исключением испытания на стерильность.

Столбнячный анатоксин. Столбнячный анатоксин, произведенный как описано в частной фармакопейной статье на вакцину для профилактики столбняка адсорбированную, должен выдерживать требования указанной частной фармакопейной статьи для нерасфасованного очищенного анатоксина, за исключением того, что антигенная чистота допускается не менее 1500 Lf на миллиграмм белкового азота, и испытание на стерильность не требуется.

Дифтерийный белок CRM 197. Дифтерийный белок CRM 197 производят при культивировании генетически модифицированных или немодифицированных (mCRM) микроорганизмов Corynebacterium diphtheriae, или получают с помощью технологии рекомбинантных ДНК, используя в качестве продуцентов, например, генетически модифицированные штаммы Escherichia coli. Супернатант культуры клеток может быть сконцентрирован ультрафильтрацией и очищен путем последовательных стадий осаждения, фильтрации и хроматографирования. В случае, когда дифтерийный белок CRM 197 производится на той же производственной площадке, что и дифтерийный токсин, он должен иметь отличия от активного токсина, четко определяемые подходящим методом. Чистота дифтерийного белка CRM 197 должна быть не менее 90%.

Поверхностный мембранный белковый комплекс Neisseria meningitidis группы B. Поверхностный мембранный белковый комплекс Neisseria meningitidis группы B выделяют из бактериальной клеточной культуры с использованием буферного раствора, содержащего детергент. Первым удаляют клеточный дебрис. Мембранный белковый комплекс может быть сконцентрирован и очищен последовательно фильтрацией и дополнительными подходящими стадиями очистки. Содержание липополисахаридов не должно превышать 8%. Относительное количество основных поверхностных мембранных белков должно быть утверждено уполномоченным органом. Поверхностный мембранный белковый комплекс должен выдерживать испытание на пирогенность (2.1.6.2): каждому кролику вводят по 0,25 мкг поверхностных мембранных белков на килограмм массы тела.

Рекомбинантный белок D. Белок D - поверхностный белок нетипичной Haemophilus influenzae. Его получают, используя генетически модифицированный штамм E. coli, несущий плазмиду с последовательностью, кодирующей белок D. Для активации экспрессии белка D, модифицированный штамм культивируют в подходящей жидкой питательной среде. В конце культивирования выполняют стадию очистки. Чистота белка D должна быть не менее 95%.