МЕТОД 4

Данный метод (обычно называемый методом количественного определения с бицинхониновой кислотой или БЦК методом) основан на восстановлении белком иона двухвалентной меди (Cu²⁺) до иона одновалентной меди (Cu⁺). Реактив бицинхониновой кислоты применяют для определения иона одновалентной меди. Протеканию реакции мешают некоторые вещества, влияние которых может быть минимизировано путем разведения, обеспечивающего концентрацию белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений. Для удаления мешающих веществ также может быть использована методика осаждения белка, описанная в разделе Метод 2. Поскольку разные виды белков могут давать различные по интенсивности окраски, стандартный образец и испытуемый белок должны быть одинаковыми.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную P.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого образца в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье, с концентрацией белка в пределах интервала концентраций калибровочной кривой.

Растворы сравнения. Готовят раствор соответствующего стандартного образца белка в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье. Порции полученного раствора разводят тем же буферном раствором для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале от 10 мкг/мл до 1200 мкг/мл.

Контрольный раствор. Буферный раствор, применяемый для приготовления испытуемого раствора и растворов сравнения.

БЦК реактив. 10 г динатрия бицинхонината P, 20 г натрия карбоната моногидрата P, 1,6 г натрия тартрата P, 4 г натрия гидроксида P и 9,5 г натрия гидрокарбоната P растворяют в воде дистиллированной P. При необходимости pH раствора корректируют раствором натрия гидроксида P или раствором натрия гидрокарбоната P до значения 11,25 и доводят водой дистиллированной P до объема 1000 мл, перемешивают.

Медно-БЦК реактив. Смешивают 1 мл раствора 40 г/л меди сульфата пентагидрата P и 50 мл БЦК реактива.

Методика. 0,1 мл каждого раствора сравнения, испытуемого раствора и контрольного раствора смешивают с 2 мл медно-БЦК реактива и перемешивают. Полученные растворы инкубируют при температуре 37 °C в течение 30 мин, отмечают время и охлаждают до комнатной температуры. Через 60 мин после окончания инкубации в кварцевых кюветах измеряют оптическую плотность (2.1.2.24) растворов сравнения и испытуемого раствора при длине волны 562 нм, используя контрольный раствор в качестве компенсационного раствора. Необходимо учитывать, что после охлаждения растворов до комнатной температуры, интенсивность их окраски постепенно увеличивается.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, однако, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочной кривой, небольшой, она приближается к линейной. Строят график зависимости оптических плотностей растворов сравнения от концентраций белка и, используя линейную регрессию, строят калибровочную кривую. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.