УПРАВЛЕНИЕ СИГНАЛОМ И АНАЛОГО-ЦИФРОВОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ

Сигналы светорассеяния и флуоресценции, испускаемые клетками при прохождении через лазерный луч, разделяются и направляются к детекторам с помощью оптических фильтров. Детекторы являются трансдукторами (фотоэлектронными умножителями), которые преобразуют световое излучение, генерируемое клетками, в импульсы напряжения.

Процесс подсчета каждого импульса в соответствующем канале является аналого-цифровым преобразованием. Процесс отображается графически в виде частотной гистограммы.

Усиление (амплификация)

Для оптимальной визуализации импульсы напряжения должны быть усилены. Процесс усиления подчеркивает различия между сигналами клетки и, следовательно, увеличивает разрешение между популяциями клеток с различными характеристиками (например, отличие жизнеспособных от нежизнеспособных клеток, или неспецифической флуоресценции от антиген-специфической флуоресценции после окраски мечеными моноклональными антителами).

Есть два метода усиления сигнала: линейный и логарифмический. Выбор между двумя типами делают для каждого отдельного сигнала в соответствии с морфологическими характеристиками клеток и используемыми красителями (например, флуоресцентно-меченые моноклональные антитела, красители нуклеиновой кислоты).

Линейное усиление увеличивает различия среди интенсивных импульсов, то есть используется с теми параметрами, которые производят сигналы высокой интенсивности, например:

- параметры светорассеяния клетки;

- флуоресценция красителей нуклеиновых кислот при изучении клеточного цикла.

Логарифмическое усиление, напротив, предназначено для слабых импульсов и параметров или аналитических условий, которые могут произвести как слабый, так и сильный импульс, например:

- антигены клетки;

- светорассеяние от тромбоцитов, бактерий, дрожжей;

- флуоресценция от красителей нуклеиновых кислот при исследовании апоптоза.

Компенсация сигналов флуоресценции

У каждого флуоресцирующего красителя есть определенный спектр поглощения и спектр эмиссии. При использовании для окрашивания клеток двух или более флуоресцентных меток одновременно (например, иммунное фенотипирование по четырем антигенам), спектры эмиссии флуорофоров могут перекрываться. Как следствие, каждый детектор флуоресценции зарегистрирует как определенную флуоресцентную метку, так и какое-то количество света, излучаемого другими флуоресцентными метками. Это может привести к завышению сигнала и плохому разделению популяций клеток.

Использование электронной матрицы позволяет селективно разделять перекрестные сигналы после их улавливания детектором (компенсация флуоресценции).

Для компенсации флуоресценции требуется использование калибраторов флуоресценции, при этом предпочтительно использование положительных образцов клеток, меченных необходимыми флуорофорами, присоединенными тем же способом, что и к антителам, используемым для анализа.