IV. Методы генетической диагностики врожденного иммунного ответа крупного рогатого скота

78. Иммунная система у млекопитающих состоит из врожденных и адаптивных иммунных ответов. Адаптивный иммунитет связан с антиген-специфическими ответами T- и B-клеток и наблюдается только у позвоночных. Toll-подобные рецепторы (TLR) играют важную роль в распознавании компонентов патогенов с последующей активацией врожденного иммунного ответа, который затем приводит к развитию адаптивных иммунных ответов.

79. У крупного рогатого скота все 10 генов TLR картированы. Определение генетического разнообразия в этих локусах в отношении устойчивости к определенным заболеваниям у домашнего скота могут быть полезны для генетического отбора по устойчивости к болезням.

80. Суть методов генетической диагностики врожденного иммунного ответа у крупного рогатого скота заключается в выделении фрагмента генов TLR из целого генома животного с помощью специфических праймеров, ограничивающих данный фрагмент.

81. Методы диагностики TLR скота включают в себя следующие этапы:

взятие проб биологического материала;

выделение ДНК;

проведение амплификации (метод ПЦР) фрагмента гена TLR и оценка качества амплификата;

анализ полученных результатов.

82. Для проведения ПЦР в объеме 25 мкл используется 50 - 100 нг геномной ДНК. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл реакционной смеси помещаются в термоциклер для проведения 30 циклов амплификации.

83. Режим амплификации TLR. Денатурация 94 °C (5 мин), 14 циклов: денатурация при 94 °C (30 сек), отжиг начиная с температуры + 7 °C и снижаясь на 0,5 °C за цикл (45 секунд) и элонгация 72 °C (40 секунд), потом еще 20 циклов денатурация при 94 °C (30 сек), отжиг при температуре (согласно таблице 1) (45 секунд) и элонгация при 72 °C (40 секунд); заключительный этап достройки матрично-праймерных комплексов проходит при 72 °C в течение 5 минут.

84. Концентрация и специфичность амплификата оцениваются электрофоретическим методом в 2% агарозном геле, напряжение 40 В в течение часа.

Амплифицированный фрагмент гена TLR представляет собой полосу, имеющую яркое, четко видимое свечение с длиной, указанной в таблице 1.

Таблица 1

Последовательность праймеров генов TLR крупного рогатого

скота с учетом температуры отжига и длиной амлификата