Электрофизиологические исследования in vitro

29. Электрофизиологические исследования in vitro могут позволить получить ценные сведения о влиянии исследуемого вещества на продолжительность потенциала действия и (или) ионные токи в сердце. Эти исследования играют важную роль при оценке потенциала удлинения интервала QT и выяснении клеточных механизмов, влияющих на реполяризацию миокарда. В электрофизиологических исследованиях in vitro используются отдельные клетки (например, гетерологичные экспрессирующие системы, дезагрегированные кардиомиоциты) либо многоклеточные препараты (например, волокно Пуркинье, сосочковая мышца, трабекулы, перфузируемый миокард, интактное сердце). Гетерологичные экспрессирующие системы (белки ионных каналов человека экспрессируются на несердечных клеточных линиях) используются для оценки влияния исследуемого вещества на определенный ионный канал. По сравнению с экспрессирующими системами дезагрегированные миоциты вызывают больше технических затруднений, но позволяют оценить влияние на продолжительность потенциала действия и ионные токи. Несмотря на то что одноклеточные препараты более хрупкие, в них минимизированы диффузионные барьеры в месте действия. Многоклеточные препараты являются стабильными тест-системами для изучения продолжительности потенциала действия. Анализ таких параметров каждой фазы потенциала действия, как V_max для фазы 0 (I_Na), APD₃₀ или APD₄₀ для фазы 2 (I_Ca) и "триангуляция" для фазы 3 (I_K), позволяет изучить влияние исследуемого вещества на определенные каналы, отвечающие за эти фазы. Кроме того, некоторые параметры потенциала действия, получаемые с помощью препарата Лангендорффа, позволяют получить сведения об аритмогенном риске.

30. Препараты тканей и клеток для анализов in vitro получают от различных видов лабораторных животных, включая кроликов, хорьков, морских свинок, собак, свиней, а иногда и от человека. Ионные механизмы реполяризации у взрослых крыс и мышей отличаются от ионных механизмов более крупных видов животных, а также человека (основные ионные токи, контролирующие реполяризацию у взрослых крыс и мышей, - I_to), поэтому использование тканей этих видов животных неприемлемо. При выборе тест-системы следует учитывать межвидовые различия с точки зрения того, какие ионные каналы сердца вносят вклад в реполяризацию сердца и продолжительность потенциала действия. При использовании нативных тканей или клеток сердца следует учитывать свойства и источник получения лекарственного препарата, поскольку распределение ионных каналов сердца зависит от расположения и вида клеток.

31. Количество изучаемых концентраций исследуемого вещества в исследованиях in vitro должно охватывать широкий диапазон, покрывающий пределы ожидаемой максимальной терапевтической плазменной концентрации и выходящий за их границы. Возрастающие концентрации исследуются до установления характеристик кривой "концентрация - ответ" или пока физико-химические эффекты не начнут ограничивать концентрацию. В идеале продолжительность экспозиции должна быть достаточной для получения равновесных электрофизиологических эффектов, если этому не препятствует жизнеспособность препарата клеток или тканей. Следует указать продолжительность экспозиции. Для определения чувствительности систем анализа in vitro следует использовать соответствующие положительные контрольные вещества.

32. К факторам, способным искажать или ограничивать интерпретацию результатов электрофизиологических исследований in vitro, относятся:

а) испытанию высоких концентраций исследуемого вещества может препятствовать его низкая растворимость в водных физиологических солевых растворах;

б) адсорбция на стекло или пластик либо неспецифическое связывание с исследуемой матрицей может снижать концентрацию исследуемого вещества в инкубационном или перфузионном растворе;

в) концентрации исследуемого вещества могут быть ограничены его цитотоксическими или физико-химическими свойствами, нарушающими целостность клеточной мембраны, что не позволит достичь электрофизиологических конечных точек;

г) клетки и ткани сердца обладают низкими метаболическими возможностями для метаболизма лекарственных препаратов, поэтому исследования in vitro с использованием исходного вещества не позволяют получить данные о влиянии метаболитов. Если доклинические или клинические исследования in vivo обнаруживают удлинение интервала QT, не согласующееся с результатами исследований in vitro с использованием исходного вещества, следует предусмотреть проведение исследований метаболитов в тест-системах in vitro.

33. При разработке новых технологий анализа калиевых каналов, которые могут быть использованы для предварительного скрининга исследуемых веществ в целях выявления "соединений - ведущих кандидатов", следует подтвердить согласованность новых и стандартных технологий перед началом использования таких новых технологий в целях экспертизы и регистрации лекарственного препарата.

34. Допускается использование протоколов конкурентного связывания, в которых исследуемые вещества изучаются на предмет их способности вытеснять радиоактивно меченый блокатор hERG-канала в клеточной линии, экспрессирующей hERG. Вместе с тем конкуренция за участки связывания с радиолигандами не позволяет получить сведения об агонистических или антагонистических эффектах испытуемого вещества на I_Kr. Более того, этот анализ не будет выявлять исследуемые вещества, связывающиеся с hERG в участках, отличных от участков связывания радиолиганда. Принимая во внимание потенциальное ограничение, такой анализ не следует считать заменой анализам фиксации потенциала (напряжения), описанным в пунктах 29 - 33 настоящих Указаний.