VI. Постановка РПГА микрометодом

6.1. РПГА проводят микрометодом в планшетах (круглодонных для иммунологических реакций однократного применения) с использованием автоматических дозаторов. Объем титруемой сыворотки составляет 0,05 мл (50 мкл). При исследовании нескольких диагностикумов использование многоканальных дозаторов ускоряет исследование, поскольку позволяет проводить разведение сыворотки синхронно в нескольких рядах планшета.

6.2. В случае если физиологический раствор (0,9%-й раствор натрия хлорида, pH 7,2 0,1) не входит в набор с диагностикумами (п. 3.2), то допускается его приготовление из химически чистого хлористого натрия (NaCl) на дважды дистиллированной или деионизированной воде (с целью предотвращения незначительных количеств солей металлов, которые могут вызвать гемолиз эритроцитов или их агглютинацию).

6.3. Исследование сыворотки:

- у взрослых и детей старше 12 лет начинают с разведения 1:50 (последнее разведение 1:1600);

- у детей от 6 до 12 лет - с разведения 1:25 (последнее разведение 1:400);

- у детей младше 6 лет применять диагностику ОКИ серологическим методом - нецелесообразно (см. главу XIII);

- для выявления антител к Vi-антигену - с разведения 1:10 вне зависимости от возраста обследуемого (последнее разведение 1:320).

6.4. Учитывая последующее двукратное разбавление сыворотки в лунках планшета 0,9%-м раствором натрия хлорида, необходимо приготовить в отдельной пробирке рабочее разведение сыворотки: для взрослых - 1:25 (например, 0,1 мл сыворотки + 2,4 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида); для детей - 1:5 (например, 0,1 мл сыворотки + 0,4 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида). Объем сыворотки зависит от количества используемых диагностикумов: для каждого диагностикума необходимо 0,05 мл рабочего разведения сыворотки, для постановки контроля - дополнительно 0,2 мл. Например, при исследовании сыворотки с четырьмя диагностикумами необходимо приготовить не менее 0,5 мл рабочего разведения: (0,05 x 4) + 0,2 + 0,1 (на потери в процессе постановки).

6.5. Последовательные двукратные разведения сывороток готовят непосредственно в планшетах, используя для этого один ряд для каждого диагностикума (достаточно 5 - 6 лунок в ряду). Во все лунки ряда вносят по 0,05 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида.

6.6. В первую лунку ряда вносят 0,05 мл из пробирки с рабочим разведением (п. 6.4) и получают разведение 1:50 (1:10 для детей или при выявлении антител к Vi-антигену). Затем делают серию последовательных разведений путем переноса 0,05 мл сыворотки из предыдущей лунки (начиная с первой) в следующую лунку ряда (заполненную тем же количеством 0,9%-го раствора натрия хлорида). При переносе содержимое лунки аккуратно перемешивают, избегая образования пузырьков. Из последней лунки удаляют 0,05 мл для сохранения одинакового объема сыворотки (в емкость с дезинфицирующим раствором).

6.7. Перед использованием флакон с диагностикумом осторожно встряхивают до получения гомогенной взвеси и полного исчезновения осадка на дне.

6.8. В каждую из лунок ряда с разведениями сыворотки добавляют соответствующий диагностикум в объеме согласно инструкции производителя (например, по 0,025 мл).

6.9. Планшеты после внесения диагностикума осторожно встряхивают и помещают в термостат при температуре 37 плюс/минус 1 °C. Учет реакции проводят согласно инструкции производителя.