Определение видов и биоваров бруцелл на основании рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов

4.16. Наибольшей дискриминирующей способностью в отношении видов бруцелл рестрикционный анализ обладал в случае использования ферментов AluI (отр2a, отр2b), EcoRI (отр2a), EcoRV (отр25), HindIII (отр25) [16].

При рестрикции продуктов амплификации локуса отр25 с помощью фермента EcoRV профиль P1 наблюдается у всех видов бруцелл за исключением B. melitensis и B. ovis, профиль P2 у вида B. ovis, а штаммы, относящиеся к виду B. melitensis вовсе не расщепляются рестриктазами. При использовании фермента HindIII с этим же генетическим локусом штаммы B. ovis имеют отличный от других видов рестрикционный профиль (P2).

При рестрикции продуктов амплификации локуса отр2a с помощью фермента EcoRI профиль P1 наблюдается у B. abortus 1, 2, 4 биоваров и R-формы, тогда как у остальных видов патогена и B. abortus 3, 5, 6, 9 биоваров - профиль P2.

При использовании фермента AluI с этим же генетическим локусом штаммы B. abortus 1, 2, 4 биоваров и R-формы имеют профиль P1, B. canis - P3, B. neotomae - P4, у остальных видов и B. abortus 3, 5, 6, 9 биоваров - профиль P2.

При рестрикции продуктов амплификации локуса отр2b с помощью фермента AluI профиль P2 наблюдается у B. ovis, тогда как у остальных видов бруцелл - P1.

4.17. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 19.

Таблица 19

Последовательность праймеров, используемых для постановки

амплификации с локусами отр2a, отр2b, отр25

ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.

Для проведения N реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфер, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,14 x (N + 1) мкл соответствующих для каждого фрагмента праймеров в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 14 пМоль), 0,4 x (N + 1) мкл Syn-Taq-ДНК полимеразы.

Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl₂. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 2 x (N + 1) мкл MgCl₂ в концентрации 25 мМоль (конечная концентрация 2 мМоль).

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 20.

Таблица 20

Режим амплификации локусов отр2a, отр2b, отр25

4.18. Рестрикцию осуществляют с использованием ферментов быстрого гидролиза FastDigest AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV), работу выполняют в соответствии с инструкциями производителя.

4.19. Регистрацию результатов рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов осуществляют методом электрофореза в 2 - 3%-м агарозном геле с этидия бромидом (желательно использовать 3%-й агарозный гель, подготовленный с применением высокоразрешающей агарозы) при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 - 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 - 40 мин.

По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.

Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос рестрицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 21 и рис. 4 - 6.

Таблица 21

Рестрикционные профили разных видов бруцелл

при проведении рестрикции локусов отр25, отр2a, отр2b

Рис. 4. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента

отр25 рестриктазами EcoRV (А) и HindIII (Б): M - маркер

молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000,

3000, 5000 п.н.), NC - нет рестрикции, характерно для B.

melitensis; P1_EcoRV-25 - характерен для B. abortus,

B. suis, B. canis, B. neotomae; P2_EcoRV-25 - характерен

для B. ovis, P1_HindIII-25 - характерен для B. abortus,

B. melitensis, B. suis, B. canis, B. neotomae;

P2_HindIII-25 - характерен для B. ovis

Рис. 5. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента omp2a

рестриктазами EcoRI (A) и AluI (Б): М - маркер молекулярных

масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000

п.н.), P1_EcoRI-2a - характерен для B. abortus (биовар 1, 2,

4 и R-форма); P2_EcoRI-2a - характерен для B. abortus (биовар

3, 5, 6, 9), B. melitensis, B. suis, B. canis, B. neotomae

B. ovis; P1_AluI-2a - характерен для B. abortus (биовар 1, 2,

4 и R-форма); P2_AluI-2a - характерен для B. abortus (биовар

3, 5, 6, 9), B. melitensis, B. suis, B. canis;

P3_AluI-2a - характерен для B. ovis;

P_4AluI-2a - характерен для B. neotomae

Рис. 6. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента omp2b

рестриктазой AluI: М - маркер молекулярных масс (100, 300,

500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), P1_AluI-2b

- характерен для B. abortus, B. melitensis, B. suis, B.

canis, B. neotomae; P2_AluI-2b - характерен для B. ovis