VII. Определение видовой принадлежности бруцелл методом MALDI-ToF MS

7.1. Применение метода MALDI-ToF MS для идентификации возбудителя бруцеллеза включает получение белковых экстрактов бруцелл, регистрацию масс-спектров, идентификацию патогена с использованием базы данных.

Методика заключается в измерении отношения массы заряженной частицы (иона) к его заряду. Полученный результат представляет собой совокупность спектральных сигналов заряженных частиц - масс-спектр.

7.2. Культивирование бруцелл осуществляют на бруцеллагаре в течение 48 ч при температуре 37 °C. Микробиологической петлей диаметром 1 мм в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл вносят одну изолированную колонию возбудителя бруцеллеза и ресуспендируют в 300 мкл ультрачистой воды.

7.3. К бактериальной суспензии возбудителя бруцеллеза добавляют 900 мкл 96%-го этилового спирта и перемешивают пипетированием. Полученную смесь инкубируют при температуре 30 °C в течение 90 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 12 000 об./мин. Полученный супернатант, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором. Пробирки с осадком повторно центрифугируют в течение 10 мин при 12 000 об./мин, образовавшуюся надосадочную жидкость отбирают одноразовым наконечником, сливая в емкость с дезинфицирующим раствором.

В пробирку с осадком вносят 100 мкл 70%-го водного раствора муравьиной кислоты и тщательно перемешивают пипетированием. К суспензии добавляют 100 мкл ацетонитрила и смесь повторно тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 4 мин на 12 000 об./мин при температуре 10 °C. Проводят контроль специфической стерильности.

7.4. Одну петлю (1 мкл) бактериальной массы эмульгируют в 300 мкл ультрачистой воды в стерильной пластиковой пробирке (объем 1,5/2,0 мл) с винтовой горловиной, снабженной крышкой с кольцевой прокладкой, и плотно закрывают.

Дозатором с одноразовым стерильным наконечником с фильтром отбирают 20 мкл полученной взвеси культуры и переносят в микропробирку 1,5 мл с винтовой горловиной, снабженной крышкой с кольцевой прокладкой, содержащей 80 мкл ТФУ, до конечной концентрации ТФУ в полученном растворе 80% и плотно закрывают.

Полученную смесь перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе 1 мин и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. Проводят контроль специфической стерильности.

7.5. Ионизацию белкового экстракта под воздействием лазера проводят в присутствии кислоты. В пластиковую пробирку объемом 1,5 мл вносят 475 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 100%-й трифторуксусной кислоты и 500 мкл ацетонитрила до конечного объема 1 мл, тщательно перемешивают.

В чистую пластиковую пробирку объемом 0,5 мл отбирают 250 мкл полученной смеси и вносят в нее 0,05 г кислоты. Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре до полного растворения внесенных кристаллов кислоты. Затем центрифугируют при 12 об./мин в течение 5 мин.

Приготовленный раствор кислоты может храниться при комнатной температуре в течение рабочего дня в темном месте (во избежание ультрафиолетового воздействия).

7.6. Анализ белковых экстрактов бруцелл проводят на металлических пластинах из нержавеющей стали. На пластину наносят 1 мкл супернатанта белкового экстракта бруцелл и высушивают при комнатной температуре в течение 5 мин. После высыхания каждую нанесенную каплю сверху покрывают 1 мкл раствора кислоты. Высушивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

Для проведения калибровки масс-спектрометра в диапазоне масс 2000 - 20000 наносят на мишень 1 мкл раствора тест-стандарта и высушивают на воздухе в течение 5 мин. Затем сверху наносят 1 мкл раствора кислоты и сушат при комнатной температуре в течение 5 мин.

Пластину с нанесенными образцами помещают в масс-спектрометр и проводят калибровку прибора. Для получения одиночного масс-спектра каждого образца используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон масса (заряд) составляет 2000 - 20000 Да. Для каждой капли образца регистрируется исходный спектр, представляющий собой сумму шести одиночных спектров (240 импульсов лазера). Сбор масс-спектров осуществляют в автоматическом режиме.

7.7. Профиль белкового экстракта культуры возбудителя бруцеллеза формируется в виде графика (рис. 12) в декартовой системе, по оси абсцисс которого расположено соотношение массы иона к заряду (m/Z), а по оси ординат - интенсивность (Intensity), и пик-листа (рис. 13), в котором содержится информация о каждом сигнале соответствующего масс-спектра, в частности m/Z, Intensity, R (разрешение сигнала), s/n (отношение сигнал/шум) и др.

Рис. 12. Масс-спектр белкового экстракта культуры

возбудителя бруцеллеза

Рис. 13. Пик-лист масс-спектра белкового экстракта культуры

возбудителя бруцеллеза

Определение видовой принадлежности бруцелл происходит автоматически в режиме реального времени путем сравнения полученных масс-спектров исследуемого образца с референсными спектрами из имеющейся базы данных (рис. 14).

Заключение о видовой принадлежности бруцелл проводят на основании следующих критериев:

- "Score" >= 2,3 соответствует достоверной идентификации до вида (зеленый цвет);

- "Score" 2,000 - 2,299 соответствует достоверной идентификации до рода и вероятной идентификации до вида (зеленый цвет);

- "Score" 1,7 - 1,999 рассматривается как вероятная идентификация до рода (желтый цвет);

- "Score" менее 1,7 - недостоверный результат (красный цвет).

Рис. 14. Идентификация штаммов бруцелл

в режиме реального времени

По итогам установления видовой принадлежности культуры возбудителя бруцеллеза автоматически формируется таксономическое дерево (рис. 15).

Рис. 15. MSP-дендрограмма масс-спектрометрических

профилей бруцелл