Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу Bruce-Ladder

4.1. Для идентификации бруцелл предложен протокол Bruce-Ladder, позволяющий определять виды B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae, B. ceti, B. pinnipedialis и вакцинные штаммы B. abortus S19, B. abortus RB51, B. melitensis Rev1 методом ПЦР-ЭФ [11].

В качестве ДНК-мишеней использованы участки генома: wboA (отсутствует у B. ovis и имеет вставку IS711 у штамма B. abortus RB51), bp26 (вставка IS711 у B. ceti/B. pinnipedialis), отр31 (делеция у B. abortus), BMEI1436-1435 (делеция у B. canis), eryC (делеция у B. abortus S19), rpsL (точечные мутации у B. melitensis Rev1), crp (делеция у B. neotomae), BR0953 (делеция у B. abortus и B. melitensis).

4.2. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 1.

Таблица 1

Последовательности праймеров,

используемых для протокола Bruce-Ladder

ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.

Для проведения N реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x DreamTaq-буфера (или специфичного буфера для эквивалентной полимеразы), 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл каждого праймера в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,2 x (N + 1) мкл Dream Taq-полимеразы.

В 10 x DreamTaq-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, поэтому, чтобы конечная концентрация ионов магния в реакционной смеси составила 3 мМоль, дополнительно вносят 1 x (N + 1) мкл MgCl₂ в концентрации 25 мМоль. Если в составе специфичного буфера для эквивалентной полимеразы ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 3 x (N + 1) мкл MgCl₂ в концентрации 25 мМоль.

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 2.

Таблица 2

Режим амплификации по протоколу Bruce-Ladder

4.3. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 - 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 - 40 мин.

По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.

Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 3 и рис. 1.

Таблица 3

Определение видовой принадлежности бруцелл

по протоколу Bruce-Ladder

Рис. 1. Результаты определения видовой принадлежности

бруцелл с помощью системы Bruce-Ladder: M - маркер

молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000,

3000, 5000 п.н.), 1 - B. abortus, 2 - B. melitensis,

3 - B. ovis, 4 - B. suis, 5 - B. canis, 6 - B. neotomae