Определение биоваров B. suis по протоколу Suis-ДИФ

4.13. Протокол Suis-ДИФ позволяет дифференцировать 1/3, 2, 4 и 5 биовары B. suis на основании выявления наличия или отсутствия амплификации фрагментов BR0262, BRA0367, BRA0378, BMEI1683 генов. С помощью протокола Suis-ДИФ исследуют только выделенные культуры бруцелл, идентифицированные как B. suis.

4.14. Для проведения реакции используют праймеры и зонды, представленные в табл. 15.

Таблица 15

Последовательность праймеров и зондов,

используемых для постановки протокола Suis-ДИФ

Название праймеров	Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов 5'-3'
BR0262f	CTTGGTTTGTAGCGGTTGAC
BR0262r	AAACGTCTTCGTCTCCTCAG
BR0262p	FAM-ATTCGATCCTCTTCAAGCGCCGT-RTQ1
BRA0367del-f	CAGTGCCGACCCACCAAG
BRA0367del-r	GATTTCTAAGGCGCTGATTGC
BRA0367del-p	ROX-CGCCCTCTGTCTCGTCTCGGCC-BHQ2
BRA0378-f	AGCATTTCCTCGTACCCACA
BRA0378-r	TGGGTCCACACATCATCGAA
BRA0378-p	Cy5-CGCGCAAGACAACCCACAGC-BHQ2
BMEI1683-f	ATGACGGGAAATGTCGCTTG
BMEI1683-r	GCCAATTAAGCGACGCAATC
BMEI1683-p	R6G-CGCGTGCAGTTCTCTCTTGCTGA-RTQ1

ПЦР проводят в объеме 25 мкл в двух пробирках. В одной пробирке осуществляют реакцию амплификации с праймерами и зондами BR0262f, BR0262r, BR0262p, BRA0367del-f, BRA0367del-r, BRA0367del-p, в другой - c BRA0378-f, BRA0378-r, BRA0378-p, BMEI1683-f, BMEI1683-r, BMEI1683-p.

Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл и в отдельных пробирках подготавливают общую реакционную смесь-1 и реакционную смесь-2, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию в соответствии с табл. 16.

Таблица 16

Подготовка реакционных смесей по протоколу Suis-ДИФ

Реагент	Концентрация	Для проведения N реакций, мкл	Реагент	Концентрация	Для проведения N реакций, мкл
Реакционная смесь-1			Реакционная смесь-2
10 x ПЦР-буфер	10 x	2,5 x (N + 1)	10 x ПЦР-буфер	10 x	2,5 x (N + 1)
дНТФ	25 мМоль	0,2 x (N + 1)	дНТФ	25 мМоль	0,2 x (N + 1)
MgCl₂	25 мМоль	2,0 x (N + 1)	MgCl₂	25 мМоль	2,0 x (N + 1)
Праймеры BR0262f BR0262r, BRA0367del-f BRA0367del-r	100 пМоль/мкл	0,08 x (N + 1)	Праймеры BRA0378-f BRA0378-r BMEI1683-f BMEI1683-r	100 пМоль/мкл	0,08 x (N + 1)
Зонды BR0262p BRA0367del-p	100 пМоль/мкл	0,04 x (N + 1)	Зонды BRA0378-p BMEI1683-p	100 пМоль/мкл	0,04 x (N + 1)
SynTaq-ДНК полимераза	5 ед/мкл	0,4 x (N + 1)	SynTaq-ДНК полимераза	5 ед/мкл	0,4 x (N + 1)

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор роторного типа и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 17.

Таблица 17

Режим амплификации по протоколу Suis-ДИФ

N	Цикл	Температура, °C	Время	Количество циклов
1	Предварительная денатурация	95	5 мин	1
2	Денатурация	95	30 с	10
	Отжиг	56	30 с
	Элонгация	72	10 с
3	Денатурация	95	30 с	35
	Отжиг	56 <*>	30 с
	Элонгация	72	10 с
Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 56 °C (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red (для красителей FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red указывают в графе Миним. Сигнал значение 5, а в графе Максим. Сигнал значение 10).

4.15. Для реакционной смеси-1 регистрацию флуоресценции осуществляют по каналам FAM и ROX для реакционной смеси-2 - по каналам JOE и Су5.

Устанавливают следующие показатели для каждого канала флуоресценции: "Логарифмическая шкала", "Динамический фон", "Устранение выбросов" - 10%, "Порог" по каналу FAM - 0,05, JOE - 0,1, ROX - 0,1, Су5 - 0,05.

Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов). Учет и интерпретацию результатов проводят в соответствии с табл. 18.

Пороговое значение Ct для положительных проб с РС-1 и РС-2 по каналам FAM, JOE, ROX, Су5 составляет не более 26.

Таблица 18

Определение биоваров B. suis по протоколу Suis-ДИФ

Вид	Реакционная смесь-1		Реакционная смесь-2
Вид	FAM (BR0262)	ROX (BRA0367)	FAM/BMEI1683)	Су5 (BRA0378)
B. suis 1/3 биовар	<= 26	<= 26	-	<= 26
B. suis 2 биовар	<= 26	-	<= 26	<= 26
B. suis 4 биовар	<= 26	-	-	<= 26
B. suis 5 биовар	<= 26	-	<= 26	-
Brucella spp., в количестве недостаточном для идентификации	<= 26	При значении Ct > 26	При значении Ct > 26	При значении Ct > 26
Требуется подтверждение принадлежности к B. suis	-	Любое значение	Любое значение	Любое значение

Определение видов бруцелл по протоколу БРУ-ДИФ Определение видов и биоваров бруцелл на основании рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов