Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу Suis-Ladder с дополнениями

4.4. Для идентификации всех биоваров B. suis, а также видов B. canis и B. microti предложен протокол Suis-Ladder, основанный на амплификации локусов BMEI1426 (делегирован у B. canis), BMEI1688 (амплифицируется только у B. suis биовары 2 и 4), BR1080 (делегирован у B. suis биовара 2), BMEI0205 (Bruce 11 - содержит тандемные повторы, количество которых отличается у разных биоваров B. suis) [12]. При амплификации локуса BMEI0205 регистрируется образование ампликонов различных размеров: 425 п.н. (6 повторов) у 1 биовара B. suis, 551 п.н. (8 повторов) у 2 биовара, 299 п.н. (4 повтора) у 3 биовара и 614 п.н. (9 повторов) у 4, 5 биоваров. У B. suis 5 биовара возможна амплификация фрагмента локуса BMEI0205 размером 488 п.н. (7 повторов) [13].

4.5. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 4.

Таблица 4

Последовательность праймеров,

используемых для протокола Suis-Ladder

ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.

Для проведения N реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфера, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл каждого праймера в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,2 - 0,4 x (N + 1) мкл SynTaq-ДНК полимеразы. Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl₂. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 2 x (N + 1) мкл MgCl₂ в концентрации 25 мМоль.

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 5.

Таблица 5

Режим амплификации по протоколу Suis-Ladder

4.6. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 - 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 - 40 мин.

По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.

Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 6 и рис. 2.

Таблица 6

Определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл

по протоколу Suis-Ladder с дополнениями

Рис. 2. Результаты определения видовой и биоварной

принадлежности бруцелл с помощью протокола Suis-Ladder:

M - маркер молекулярных масс (100, 200, 300, 500, 700, 1000

п.н.), 1, 2 - B. suis 5 биовар (777/488/278/197 п.н.),

3 - B. suis 1 биовар (777/425/197 п.н.), 4 - B. suis

2 биовар (774/551/278 п.н.), 5 - B. suis 3 биовар

(774/299/197 п.н.), 6 - B. suis 4 биовар

(774/614/197 п.н.), 7 - B. suis 5 биовар

(774/614/278/197 п.н.)