V. Генотипирование штаммов B. melitensis методом INDEL-типирования

5.1. К одному из простых и информативных способов типирования штаммов B. melitensis можно отнести метод INDEL-типирования [17].

Методика заключается в выявлении вставок-делеций (INsertion-DELetion) в 10 INDEL-локусах путем определения размера ампликона после ПЦР, что позволяет выявлять индивидуальные различия между штаммами.

5.2. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 22.

Таблица 22

Праймеры для амплификации INDEL-локусов B. melitensis

ПЦР проводят в объеме 20 мкл. Для проведения реакции амплификации в пробирке отдельно для каждого локуса подготавливают реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию. Для проведения N реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл смеси дНТФ, 0,2 x (N + 1) мкл каждого праймера (конечная концентрация 10 пмоль), 0,5 x (N + 1) мкл полимеразы (TaqF), 5 x (N + 1) мкл 5х буфер для полимеразы (+MgCl₂) и 1,6 x (N + 1) мкл РНК-элюента.

Готовую смесь вносят по 10 мкл на дно пластиковых пробирок и добавляют 10 мкл выделенной ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 23.

Таблица 23

Режим амплификации для INDEL-генотипирования

5.3. Учет полученных данных проводят методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 - 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 - 40 мин.

По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.

Анализ результатов проводят по наличию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме, затем определяют размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма, сравнивая их с маркером молекулярных масс (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации штамма B.

melitensis C-573 по результатам INDEL-типирования:

М - маркер молекулярных масс (100, 200, 300, 500, 700, 1000

п.н.), AM1, AM2 - аллельные маркеры, размер ампликонов

исследуемого штамма (п.н.): RS05410 - 86, RS06765 - 98,

RS11140 - 80, RS12095 - 88, RS12365 - 76, RS14755 - 91,

RS16525 - 72, RS05465 - 61, RS14470 - 84, RS16540 - 78

Определение индивидуального генетического профиля исследуемых штаммов B. melitensis проводят согласно табл. 24.

Таблица 24

Размеры INDEL-локусов B. melitensis

5.4. Определение степени генетического родства между изолятами проводят с помощью филогенетического анализа, который отображен графически (рис. 8) в виде дендрограммы (филогенетического дерева).

Рис. 8. Фрагмент дендрограммы штаммов B. melitensis

по результатам INDEL-типирования