"МР 3.1.0288-22. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Идентификация и типирование штаммов бруцелл с использованием молекулярно-биологических методов. Методические рекомендации" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 30.05.2022)

Определение видов бруцелл по протоколу БРУ-ДИФ

4.10. Протокол БРУ-ДИФ позволяет идентифицировать шесть видов бруцелл: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae на основании выявления наличия или отсутствия амплификации фрагментов bcsp31, BRA0541, BRA0420, BMEI1426, BMEII0711, BMEI0994 генов [15].

4.11. Для проведения реакции используют праймеры и зонды, представленные в табл. 10.

Таблица 10

Последовательность праймеров и зондов,

используемых для постановки протокола БРУ-ДИФ

Название праймеров

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов 5'-3'

bcsp31-F

GCTCGGTTGCCAATATCAATGC

bcsp31-R

GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG

bcsp31p

FAM-AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-RTQ1

BRA0541-F

CCTCACATCAGCCAGAACAT

BRA0541-R

TTGGTATTACAAACTGGAAAGCA

BRA0541p

R6G-TGCCACCGCAAGCAGAAACG-RTQ1

BRA0420-F

CCGTCGATTACGCTACCTTT

BRA0420-R

TAACGCAGAGATCGTCCTTG

BRA0420p

ROX-ATGGTTTGCCGCCAATGCC-BHQ2

BMEI1426-F

CGCTCGCACAACTGACAT

BMEI1426-R

GAAATCGAGCAGCAGAATGA

BMEI1426p

FAM-TTCTGCTGGTCGCAGCCGTT-RTQ1

BMEII0711-F

GGTGAGCAAAGTTGTCGATG

BMEII0711-R

AGATATTTGCTCCAGGCACA

BMEII0711p

R6G-CGCCGTGATCTCCGCCTTCT-RTQ1

BMEI0994-F

TGATGGCAAGAATGCTTAGG

BMEI0994-R

CTACCGGAGAGGACAAAGGA

BMEI0994p

ROX-ACCGTCCATTTGCCAACCCG-BHQ2

ПЦР проводят в объеме 25 мкл в двух пробирках. В одной пробирке осуществляют реакцию амплификации с праймерами и зондами bcsp31-F, bcsp31-R, bcsp31p, BRA0420-F, BRA0420-R, BRA0420p, BRA0541-F, BRA0541-R, BRA0541p, в другой - с BMEI1426-F, BMEI1426-R, BMEI1426p, BMEII0711-F, BMEII0711-R, BMEII0711р, BMEI0994-F, BMEI0994-R, BMEI0994p.

Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл и в отдельных пробирках подготавливают общую реакционную смесь-1 и реакционную смесь-2, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию в соответствии с табл. 11.

Таблица 11

Подготовка реакционных смесей по протоколу БРУ-ДИФ

Реагент

Концентрация

Для проведения N реакций, мкл

Реагент

Концентрация

Для проведения N реакций, мкл

Реакционная смесь-1

Реакционная смесь-2

10 x ПЦР-буфер

10 x

2,5 x (N + 1)

10 x ПЦР-буфер

10 x

2,5 x (N + 1)

дНТФ

25 мМоль

0,2 x (N + 1)

дНТФ

25 мМоль

0,2 x (N + 1)

MgCl2

25 мМоль

2,0 x (N + 1)

MgCl2

25 мМоль

2,0 x (N + 1)

Праймеры

bcsp31-F

bcsp31-R

BRA0420-F

BRA0420-R

BRA0541-F

BRA0541-R

100 пМоль/мкл

0,08 x (N + 1)

Праймеры

BMEI1426-F

BMEI1426-R

BMEII0711-F

BMEII0711-R

BMEI0994-F

BMEI0994-R

100 пМоль/мкл

0,08 x (N + 1)

Зонды bcsp31p

BRA0420p

BRA0541p

100 пМоль/мкл

0,04 x (N + 1)

Зонды BMEI1426p BMEII0711p BMEI0994p

100 пМоль/мкл

0,04 x (N + 1)

SynTaq-ДНК полимераза

5 ед/мкл

0,4 x (N + 1)

SynTaq-ДНК полимераза

5 ед/мкл

0,4 x (N + 1)

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени и проводят реакцию в соответствии с режимом, приведенным в табл. 12.

Таблица 12

Режим амплификации по протоколу БРУ-ДИФ

N

Цикл

Температура, °C

Время

Количество циклов

Для амплификаторов роторного типа

1

Предварительная денатурация

95

5 мин

1

2

Денатурация

95

30 с

10

Отжиг

60

30 с

Элонгация

72

30 с

3

Денатурация

95

20 с

35

Отжиг

57 <*>

20 с

Элонгация

72

20 с

Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 57 °C (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange (для красителей FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange указывают в графе Миним. Сигнал значение 5, а в графе Максим. Сигнал значение 10).

Для амплификаторов планшетного типа

1

Предварительная денатурация

95

5 мин

1

2

Денатурация

95

30 с

45

Отжиг

57 <*>

30 с

Элонгация

72

30 с

Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 57 °C по каналам FAM, HEX, ROX.

4.12. Регистрацию и учет результатов ПЦР с РС-1 и РС-2 проводят по отдельности в зависимости от используемого амплификатора.

Для амплификаторов роторного типа устанавливают следующие показатели для каждого канала флуоресценции: "Логарифмическая шкала", "Динамический фон", "Корректировка уклона", "Устранение выбросов" - 10%, порог по каналу FAM - 0,05, JOE - 0,1, ROX - 0,1.

Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов). Учет и интерпретацию результатов проводят для приборов роторного типа в соответствии с табл. 13, для приборов планшетного типа - табл. 14.

Пороговое значение Ct для положительных проб с РС-1 и РС-2 по каналам FAM, JOE/HEX, ROX составляет не более 26 для амплификаторов роторного типа, 38 - для планшетного типа.

Таблица 13

Определение видовой принадлежности бруцелл по протоколу

БРУ-ДИФ для амплификаторов роторного типа

Вид

Реакционная смесь-1

Реакционная смесь-2

FAM bcsp31

JOY BRA0541

ROX BRA0420

FAM BMEI1426

JOY BMEII0711

ROX BMEI0994

B. abortus

<= 26

<= 26

-

<= 26

<= 26

<= 26

B. melitensis

<= 26

-

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

B. suis

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

B. canis

<= 26

<= 26

<= 26

-

<= 26

<= 26

B. ovis

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

-

B. neotomae

<= 26

<= 26

<= 26

<= 26

-

<= 26

Brucella spp. штамм генетически измененный

<= 26

Получение двух или более отрицательных результатов по любым каналам

Brucella spp., в количестве недостаточном для видовой идентификации

<= 26

При значение Ct > 26 по одному или нескольким каналам

Требуется подтверждение принадлежности к роду Brucella

-

Любое значение

Таблица 14

Определение видовой принадлежности бруцелл по протоколу

БРУ-ДИФ для амплификаторов планшетного типа

Вид

Реакционная смесь-1

Реакционная смесь-2

FAM bcsp31

JOY BRA0541

ROX BRA0420

FAM BMEI1426

JOY BMEII0711

ROX BMEI0994

B. abortus

<= 38

<= 38

-

<= 38

<= 38

<= 38

B. melitensis

<= 38

-

<= 38

<= 28

<= 38

<= 38

B. suis

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

B. canis

<= 38

<= 38

<= 38

-

<= 38

<= 38

B. ovis

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

-

B. neotomae

<= 38

<= 38

<= 38

<= 38

-

<= 38

Brucella spp. штамм генетически измененный

<= 38

Получение двух или более отрицательных результатов по любым каналам

Brucella spp., в количестве недостаточном для видовой идентификации

<= 38

При значение Ct > 38 по одному или нескольким каналам

Требуется подтверждение принадлежности к роду Brucella

-

Любое значение

Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу AMOS-DEL Определение биоваров B. suis по протоколу Suis-ДИФ