Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу AMOS-DEL

4.7. Для идентификации B. abortus (1, 2, 4 и 3, 5, 6, 9 биовары), B. melitensis, B. suis (1 биовар), B. ovis используется протокол AMOS-ERY [14], основанный на определении расположения инсерционной последовательности IS711 в геноме патогена и амплификации фрагмента гена ery, специфичного для всех бруцелл. Для выполнения такой апмлификации используется один универсальный праймер, гомологичный последовательности IS-элемента (PIS 711), а в пару с ним подобраны олигонуклеотиды, комплементарные локусам B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis 1 биовара (PBa, PBm, PBo, PBs, DEL 569 соответственно). Предложено исключить из данной системы амплификацию родоспецифичного гена ery и обозначить модификацию AMOS-DEL [13].

4.8. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 7.

Таблица 7

Последовательность праймеров,

используемых для протокола AMOS-DEL

ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.

Для проведения N реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфер, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл праймеров PBa, PBm, PBo, PBs, DEL569 в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,25 x (N + 1) мкл праймера PIS711 в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 25 пМоль), 0,4 x (N + 1) мкл Syn-Taq-ДНК полимеразы.

Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl₂. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 1,5 x (N + 1) мкл MgCl₂ в концентрации 25 мМоль.

Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 8.

Таблица 8

Режим амплификации по протоколу AMOS-DEL

4.9. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 - 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 - 40 мин.

По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.

Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 9 и рис. 3.

Таблица 9

Определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл

по протоколу AMOS-DEL

Рис. 3. Результаты определения видовой и биоварной

принадлежности бруцелл с помощью протокола AMOS-DEL:

M - маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000,

1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), 1 - B. abortus биовары 1, 2,

4 - 498 п.н., 2 - B. abortus биовары 3, 5, 6, 9 - 1700

п.н., 3 - B. melitensis - 731 п.н.,

4 - B. suis 1 биовара - 268 п.н.,

5 - B. ovis - 976 п.н.