VI. Лабораторная диагностика лихорадки Ку

6.1. Постановка диагноза "лихорадка Ку" вследствие полиморфизма клинического течения осуществляется после лабораторного подтверждения. Лабораторная диагностика лихорадки Ку осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <13>.

--------------------------------

<13> Пункты 1418 - 1422 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

6.2. Диагноз "лихорадка Ку" у человека считается установленным при лабораторном подтверждении любым из существующих методов (серологическим или молекулярно-биологическим), а также у больного с клиническими симптомами лихорадки Ку при подтвержденном случае коксиеллеза у контактного животного.

6.3. Рекомендуются следующие клинико-эпидемиологические показания к проведению обследования больных на лихорадку Ку:

- больные с лихорадкой различного типа более 5 дней и симптомами интоксикации различной степени выраженности;

- больные с лихорадкой и поражением дыхательной системы в виде бронхитов и пневмоний;

- больные с лихорадкой и экзантемой полиморфного характера;

- больные с лихорадкой и поражением гепатобиллиарной системы (гепатомегалия, желтуха различной интенсивности);

- больные, поступающие из природного очага лихорадки Ку.

Материалом для исследований на лихорадку Ку являются:

- от больных или подозрительных на заболевание людей: кровь и ее компоненты, мокрота, промывные воды бронхов, спинномозговая жидкость и др.;

- трупный материал: кровь, секционный материал органов и др.;

- материал от сельскохозяйственных и диких животных (органы, биологические жидкости, абортированные плоды), членистоногих;

- продовольственное сырье, продукция животного происхождения и др.;

- объекты окружающей среды: почва, вода, воздух и др.

6.4. Отбор, передача, транспортировка, хранение и исследование материала на лихорадку Ку выполняются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <14>. Отбор проб клинического материала для исследования, их упаковку и транспортирование осуществляет медицинский персонал.

--------------------------------

<14> Пункты 493 - 506, 512 - 530 главы IV, пункты 1423 - 1424 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

6.5. Для лабораторной диагностики лихорадки Ку у человека и при осуществлении эпидемиологического надзора применяются иммунологические (серологические), молекулярно-биологические и биологические методы, которые предназначены как для выявления (и выделения) самого возбудителя (его ДНК и антигенов), так и антител к C. burnetii. При серологической диагностике применяются ИФА (РНИФ, РСК). У больных преобладают антитела к антигену C. burnetii II фазы; антитела к антигену I фазы преобладают при формировании хронического течения заболевания. Рекомендуется комплексное применение взаимодополняющих методик для объективной постановки диагноза и решения конкретных эпидемиологических задач.

6.6. Серологические и молекулярно-генетические исследования без накопления возбудителя могут проводиться в бактериологических лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности <15>. Исследования по выделению из материала от больных возбудителя инфекции или его генома, связанные с накоплением возбудителя (микробиологические, молекулярно-генетические исследования), проводятся в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность микроорганизмами I - II групп патогенности <16>. Выявление C. burnetii и выделение культуры данного патогена при исследовании материала, полученного от животных, трупного материала или объектов окружающей среды осуществляется теми же методами, что и материала от больного человека.

--------------------------------

<15> Пункт 1419 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

<16> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

6.7. При работе по выделению C. burnetii персонал лаборатории должен быть вакцинирован <17> и защищен от возможного аэрогенного заражения. Используется метод биопроб на морских свинках, беспородных белых мышах, культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов (далее - РКЭ) и культуре клеток, исследование иксодовых клещей. Указанные виды работ выполняют сотрудники аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <18>. В такой лаборатории может осуществляться комплексное исследование материала (от больных людей и сельскохозяйственных животных, секционного материала, образцы из объектов окружающей среды: клещи, пищевые продукты, почва и др.) при лабораторной диагностике лихорадки Ку с последующим выделением штамма C. burnetii по схеме, приведенной в приложении 4 к настоящим МР.

--------------------------------

<17> Пункт 1461 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

<18> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.8. Лабораторная диагностика лихорадки Ку у людей осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями с использованием диагностических препаратов (медицинских изделий), зарегистрированных на территории Российской Федерации <19>. С применением медицинских изделий осуществляются серологические и молекулярно-биологические исследования при диагностике лихорадки Ку и выявлении ДНК C. burnetii в образцах окружающей среды (приложение 5 к настоящим МР).

--------------------------------

<19> Пункт 1418 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

6.9. Индикация возбудителя лихорадки Ку.

6.9.1. Полимеразная цепная реакция. Наряду с серологическими методами постановка диагноза "лихорадка Ку" основывается на детекции ДНК C. burnetii в биологическом материале от больного (кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Для дифференциации штаммов применяется мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов (multiple locus variable-number tandem repeats analysis) (далее - MLVA). Для выявления ДНК C. burnetii в различных биологических материалах, включая пробы от сельскохозяйственных и диких животных, иксодовых клещей, используются различные варианты ПЦР с праймерами, комплементарными специфическим фрагментам генов плазмид и хромосомы.

6.9.2. Для выявления ДНК возбудителя лихорадки Ку методом ПЦР и ПЦР в режиме реального времени применяются разные генетические маркеры. С применением ПЦР-тест-систем обеспечивается высокая специфичность молекулярно-генетической детекции C. burnetii с отсутствием перекрестных реакций в отношении других возбудителей природно-очаговых инфекций. В то же время не исключается полностью вероятность детекции близкородственных микроорганизмов (Coxiella spp.), патогенность которых для человека к настоящему времени не установлена. В положительных пробах, учитывая широкое распространение Coxiella spp. у членистоногих (клещей разных таксономических групп), для их дифференциации от C. burnetii рекомендуется секвенировать протяженные фрагменты гена 16S рРНК (вариабельные локусы), генов groEL и rpoB. Также следует учитывать в некоторых случаях возможность присутствия в пробе ДНК нежизнеспособного патогена C. burnetii.

6.9.3. Работы по детекции ДНК C. burnetii выполняют в соответствии с методическими указаниями <20>.

--------------------------------

<20> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

6.9.4. Исследуется материал от людей (цельная периферическая кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал: ткани мозга, сердца, легких, селезенка), животных (кровь, плацента, абортивный материал, секционный материал: селезенка) и иксодовые клещи (рода Rhipicephalus, Haemaphysalis, Dermacentor и Ixodes). Кровь, мокроту, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 суток. При поступлении в лабораторию проводится пробоподготовка крови, ликвора, промывных вод бронхов с получением бактериального осадка и с последующей экстракцией нуклеиновых кислот или проба замораживается для длительного хранения. Клещи хранятся живыми до 1 месяца или 1 неделю при температуре не выше минус 16 °C, далее при температуре не выше минус 68 °C. Секционный и абортивный материал, а также плацента хранятся 1 неделю при температуре не выше минус 16 °C, далее при температуре не выше минус 68 °C. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

6.9.5. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены корректные результаты для положительного и отрицательного контроля амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК в соответствии с данными таблицы оценки результатов контрольных реакций.

6.10. Выделение возбудителя лихорадки Ку.

Из образцов проб, в которых было подтверждено наличие генетических мааркеров или антигенов C. burnetii, в специализированных лабораториях, имеющих разрешительную документацию на работу с возбудителем лихорадки Ку, может быть продолжена работа по выделению штамма методом биопроб и культуральными методами.

6.10.1. Культивирование C. burnetii в организме чувствительных лабораторных животных.

Для постановки биологических проб (далее - биопроб) при лихорадке Ку используется тот же материал, что и при постановке ПЦР. Для постановки биопроб используются морские свинки (250 - 300 г), белые мыши (12 - 14 г) и 7-дневные РКЭ.

Лабораторные животные используются для первичного накопления C. Burnetii, если исследуемые пробы обильно контаминированы посторонней микрофлорой. Контроль контаминации гетерологичными бактериями осуществляется на стандартных питательных средах.

Исследуемый материал растирается, добавляется стерильный физиологический раствор, тщательно эмульгируется и после отстаивания взвеси (или центрифугирования при малых оборотах) вводится внутрибрюшинно или подкожно подопытным морским свинкам (2 - 3 мл) или белым мышам (0,5 - 1,0 мл). При исследовании крови сыворотка отделяется стерильно от сгустка и используется для серологического исследования. Сгусток измельчается в гомогенизаторе (при необходимости растирается в ступке), эмульгируется в физиологическом растворе и вводится внутрибрюшинно лабораторным животным.

У морских свинок в результате заражения примерно через неделю развивается лихорадка (до 40 - 41 °C), продолжающаяся 5 - 7 дней. C. burnetii в большом количестве накапливаются в легких, печени и других органах. У белых мышей инфекция протекает в скрытой форме, с накоплением большого количества C. burnetii в селезенке на 7 - 9-й день после заражения.

Положительный результат экспериментов доказывается обнаружением возбудителя в мазках-отпечатках из органов животных микроскопией, детекцией ДНК C. burnetii, а также выявлением в сыворотке их крови специфических антител.

Серологическое исследование экспериментальных животных проводится первый раз через 25 - 30 дней, второй - через 2 месяца. При выявлении в сыворотке антител при первом исследовании животные забиваются, эмульсией селезенок заражаются РКЭ, параллельно проводят пассаж на свежих морских свинках.

6.10.2. Заражение морских свинок для выделения штаммов C. burnetii

Для воспроизведения лихорадки Ку чувствительной моделью являются морские свинки. Для заражения используется кровь больного, гомогенизаты различного происхождения (клещи, органы животных), смывы с объектов окружающей среды и др., в которых по данным ПЦР были обнаружены генетические маркеры C. burnetii, антигены C. burnetii с помощью ИФА или гомогенизаты селезенок лабораторных мышей, в которых по методу Гименеса было выявлено небольшое количество возбудителя.

Морские свинки (самцы) заражаются путем введения в брюшную полость инфекционного материала (лиофилизированная культура живых C. burnetii, суспензии из желточных мешков РКЭ, зараженных C. burnetii, и органов биопробных животных, суспензия из иксодовых клещей и культур клеток). С этой целью лиофилизированная культура живых C. burnetii растворяется в расчетном объеме стерильного фосфатного буферного раствора pH 7,2 0,1. Суспензия из желточного мешка готовится из расчета 3 - 5 мл стерильного физиологического раствора на 1 желточный мешок. Из органов морской свинки готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе. Из отмытых в 70%-м спирте и стерильном физиологическом растворе иксодовых клещей готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе.

Заражение морских свинок проводится сотрудниками аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <21>.

--------------------------------

<21> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Проверка контаминированности проб гетерологичными бактериями и при необходимости их обработка антибиотиками проводится так же, как при заражении мышей. Морским свинкам внутрибрюшинно вводится 0,5 мл инфицированного материала. Животным ежедневно ректально измеряется температура. Обычно через неделю (срок зависит от дозы C. burnetii) развивается лихорадка (40 - 41 °C), продолжающаяся 4 - 7 дней. В первые дни лихорадки у животного забирается кровь и исследуется с помощью ПЦР. При получении положительного результата этой пробой крови инокулируются РКЭ.

6.10.3. Культивирование C. burnetii на лабораторных мышах.

В качестве лабораторных животных для культивирования C. burnetii обычно используются лабораторные мыши. Различные линии (штаммы) мышей существенно различаются по чувствительности к C. burnetii. Мыши линии A/J более чувствительны к этому патогену, чем C57BL/6J. Из экономии часто работают на белых беспородных мышах (самцах). Их чувствительность к C. burnetii повышается при применении иммунодепрессантов.

При бактериальной контаминации в гомогенизированные пробы добавляются пенициллин (200 ЕД/мл) и стрептомицин (400 ЕД/мл), выдерживаются при комнатной температуре один час и внутрибрюшинно вводятся белым мышам (массой 12 - 14 г) в объеме 0,5 мл. У белых мышей инфекция протекает в скрытой форме, с накоплением C. burnetii в селезенке на 7 - 9 день после заражения. Селезенка стерильно извлекается, готовятся мазки-отпечатки, окрашиваются по методу Гименеса и микроскопируются. Из селезенок мышей, содержащих C. burnetii, стерильно готовятся гомогенезированные пробы для последующего культивирования в РКЭ.

6.10.4. Культивирование C. burnetii в развивающихся куриных эмбрионах.

Исходным материалом (особенно сгустком крови) заражаются и непосредственно РКЭ. В желточный мешок 6 - 7-дневных развивающихся эмбрионов вводится 0,4 - 0,5 мл взвеси исследуемого материала. РКЭ инкубируются в термостате (37 °C) и ежедневно овоскопируются. РКЭ, погибшие до 4-го дня включительно, уничтожаются (гибель от посторонних причин), а погибшие в более поздние сроки или оставшиеся живыми до предельного срока инкубации (11 - 12 дней после заражения) помещаются в холодильник до вскрытия.

Эмбрионы вскрываются стерильно берется желточный мешок, капля содержимого желточного мешка вносится в сахарный бульон для контроля на загрязнение посторонней бактериальной флорой. Из кусочка оболочки желточного мешка делаются параллельные мазки. Один из них обрабатывается специфической флуоресцирующей сывороткой, а парный окрашивается по Здродовскому или по Романовскому-Гимзе для световой микроскопии. Небольшой фрагмент оболочки желточного мешка берется для исследования с помощью ПЦР.

Для выделения и пассирования C. Burnetii кроме РКЭ и морских свинок можно использовать белых мышей массой 12 - 14 г, которые заражаются внутрибрюшинно исследуемым материалом. Изолированные культуры C. burnetii могут быть лиофильно высушены. В сухом виде культуры C. burnetii в холодильнике (4 °C) могут сохраняться в течение десятков лет.

Техника заражения и вскрытия РКЭ. При заражении и вскрытии РКЭ (приложение 7 к настоящим МР) технологические операции выполняются сотрудниками аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <22>.

--------------------------------

<22> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.10.5. Культивирование C. burnetii с применением бесклеточной среды.

В последние годы применяется бактериологический метод с использованием бесклеточной среды. Среда рекомендуется для культивирования C. burnetii из клинического материала и культивирования "чистых" штаммов C. burnetii. Однократную среду готовят согласно инструкции производителя, стерилизуют фильтрацией через мембраны 0,22 мкм.

Исследуемый материал при хронической форме лихорадки Ку, кусочки клапанов сердца, гомогенизируются в 3 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. 0,6 мл суспензии ткани добавляются к бесклеточной среде до конечного объема 20 мл и культивируются во флаконе "Для клеточных культур" площадью дна 25 см² в газовой среде, содержащей 92,5% N₂, 5% CO₂, 2,5% O₂. На 5-е, 7-е и 14-е сутки после инокуляции отбираются аликвоты. Количество C. burnetii определяется микроскопированием с помощью окраски по методу Гименеса. Удовлетворительным накоплением считаются десятки микробных клеток не менее чем в 50% полей зрения. Если количество C. burnetii меньше, суспензией бактерий инокулируются РКЭ. При удовлетворительном количестве C. burnetii проводится их идентификация.

6.10.6. Идентификация и хранение C. burnetii.

Идентификация выделенной культуры C. burnetii проводится в два этапа.

1-й этап: исследование с помощью реагентов (тест-систем) для выявления ДНК C. burnetii методом ПЦР.

2-й этап: для подтверждения амплификации ДНК C. burnetii используется метод ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру гена 16S рРНК. Суммарная ДНК из исследуемого образца выделяется с помощью общедоступных наборов для выделения ДНК; для постановки ПЦР применяются общедоступные мастер-миксы или наборы реагентов. ПЦР проводится с использованием праймеров E8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG и E1541R AAGGAGGTGATCCANCCRCA; конечная концентрация праймеров 0,5 мкМ. Условия амплификации: денатурация 2 минуты при 94 °C; 30 циклов - 1 минута при 94 °C, 1 минута при 55 °C, 1 минута при 72 °C, 10 минут при 72 °C. Ампликоны (продукты ПЦР) очищаются с помощью общедоступных наборов для очистки продуктов ПЦР и анализируются с помощью секвенирования по методу Сэнгера с помощью анализаторов нуклеиновых кислот (секвенаторов) и соответствующих расходных реагентов для каждого типа анализатора с помощью секвенирующих праймеров E341R (TGCIGCCICCCGTAGG) и E1115F (CAACGAGCGCAACCCT). Анализ электрофореграмм и последовательности гена проводится с помощью общедоступного программного обеспечения. Для реконструкции филогенетических деревьев по сравнению штаммов и изолятов рекомендуется применять выравнивание по алгоритму MUSCLE, построение по алгоритму Neighbor-joining с бутстрепом не менее 500.

После идентификации C. burnetii, содержащиеся в удовлетворительном количестве в оболочках желточных мешков, клеточных культурах или выращенные на бесклеточной среде, помещаются в ампулы, лиофильно высушиваются или хранятся при температуре минус 80 °C. Жизнеспособность C. burnetii сохраняется в течение десятков лет.

6.10.7. Внутривидовое типирование C. burnetii.

Методы микробиологического анализа не позволяют выделить специфические особенности фенотипа отдельных штаммов C. burnetii или их групп. Их применение затрудняется чрезвычайно высокой контагиозностью патогена, специфической внутриклеточной нишей, в которой микроорганизм обитает в естественных условиях, и сложной процедурой культивирования. Типирование C. burnetii проводится с помощью методов молекулярной биологии. Идентификация отдельных изолятов C. burnetii и их групп с помощью молекулярно-биологических методов является важнейшим инструментом в изучении эпидемиологических вопросов при возникновении вспышек лихорадки Ку и решении фундаментальных задач при изучении эволюции этого патогена.

6.10.8. Определение геномной группы изолята.

При исследовании геномных характеристик C. burnetii по доступным в базах данных полным геномам выделяется шесть или восемь геномных групп, изоляты которых характеризуются определенными свойствами и обнаруживаются в определенных географических регионах. Штаммы отдельных геномных групп характеризуются разным патогенетическим потенциалом при оценке с использованием модельных животных (морских свинок).

Разделение на геномные группы является трудоемким процессом из-за необходимости использования систем высокопроизводительного секвенирования для получения нуклеотидных последовательностей штамма или геномной гибридизации на микрочипах и ввиду отсутствия общепринятого, стандартизированного протокола обработки данных (пайплайна). Отдельные алгоритмы и программные продукты для анализа геномов позволяют проводить исследования в области молекулярной эпидемиологии C. burnetii.

6.10.9. Типирование C. burnetii с использованием спейсерных участков генома.

Применяется методика генотипирования штаммов и изолятов C. burnetii с помощью анализа нуклеотидной последовательности некодирующих межгенных спейсеров (multi-spacer types) (далее - MST), более вариабельных, чем кодирующие участки генома. Метод основывается на применении ПЦР с праймерами к консервативным участкам спейсеров с последующим секвенированием ампликонов по Сэнгеру. Подход применяется для типирования штаммов и изолятов C. burnetii, выделяется более 60 разных типов MST. Этот метод называется "геотипированием", так как наблюдается приуроченность отдельных типов к определенным географическим регионам. При этом существуют типы, распространенные на нескольких континентах. Панель из спейсеров, обладающая максимальной дискриминирующей способностью, состоит из десяти спейсеров, в некоторых исследованиях типирование проводится с частью спейсеров.

6.10.10. Мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов.

Методика типирования штаммов и изолятов C. burnetii с помощью оценки длин тандемных повторов апробирована на выборке из изолятов различного географического происхождения с использованием 17 локусов мини- и микросателлитов. MLVA позволяет оценить длину локуса сателлита не только с помощью секвенирования по Сэнгеру, но и с помощью фрагментного анализа с флюоресцентно меченным праймером. При одновременном исследовании изолятов методами MLVA и MST при конкордантных результатах MLVA оказывается более дискриминативным методом. В зависимости от технических возможностей выбирается MST или используются оба метода для более полной характеристики изолятов.

6.11. Применение иммунологических (серологических) методов для диагностики лихорадки Ку.

Специфическая диагностика лихорадки Ку осуществляется с помощью серологических методов. В ответ на заражение C. burnetii в организме человека на ранних стадиях инфекции образуются антитела на белковые компоненты микробной клетки - антитела к C. burnetii II фазы. На поздней стадии острой инфекции или при хроническом течении болезни синтезируются антитела к C. burnetii I фазы, вырабатывающиеся к липополисахаридным компонентам клетки возбудителя.

6.11.1. Получение и хранение материала для серологической диагностики.

Для серологического исследования (определение антител) забираются две пробы сыворотки крови: 1-я проба берется в день постановки предварительного диагноза (5 - 6 дни болезни), 2-я проба - через 1 - 2 недели после первой. Взятие крови осуществляется из вены в объеме 3 - 4 мл или из третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 - 1,0 мл в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Пробы крови отстаиваются при комнатной температуре в течение 30 минут или помещаются в термостат при 37 °C на 15 минут. После центрифугирования (10 минут при 3000 об./мин) сыворотка переносится в стерильные пробирки. Для каждого образца используется отдельный наконечник с аэрозольным барьером. Срок хранения цельной крови - не более 6 часов при комнатной температуре, при температуре 2 - 8 °C в течение 5 - 10 суток, замораживание недопустимо. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °C не более 1 года. Перед использованием образцы размораживаются при температуре от 16 °C до 25 °C и перемешиваются встряхиванием. Образцы проб сывороток, содержащие агрегаты и осадок, осветляются центрифугированием в течение 10 минут при 6000 об./мин.

Не допускается использование исследуемого материала, прошедшего термообработку, консервированного азидом натрия, с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериальным проростом, что может привести к ложноположительным результатам. Повторное замораживание сыворотки не допускается.

Иммунологические методы диагностики лихорадки Ку включают в себя серологические тесты. Наиболее часто применяется ИФА, из "классических" серологических методов, эффективно применявшихся ранее, - РСК и РА, которая ранее считалась обязательной для лабораторного подтверждения диагноза лихорадки Ку. Были разработаны дополнительные иммунологические пробы: реакция микроагглютинации с диагностикумом из C. burnetii, меченных изотиоционатом флуоресцеина, реакция непрямой иммунофлуоресценции по методу Кунса и реакция кольцепреципитации с растворимым антигеном из C. burnetii I-й фазы.

Иммунологические реакции применяются для лабораторного подтверждения диагноза лихорадки Ку у больных людей и выявления переболевших, обнаружения инфекции у сельскохозяйственных и домашних животных, среди диких грызунов, для оценки эффективности вакцинации и других эпидемиологических вопросов. Серологические реакции - необходимый этап комплекса исследований по изоляции и идентификации возбудителя.

Серологическая диагностика лихорадки Ку у людей осуществляется с использованием диагностических препаратов, зарегистрированных на территории Российской Федерации <23>. Тест-системы предназначаются для серологической текущей и ретроспективной in vitro диагностики лихорадки Ку по наличию антител IgG-класса в сыворотке крови человека с помощью качественного иммуноферментного анализа. Наборы реагентов применяются для осуществления мероприятий по контролю и профилактике внебольничных пневмоний для исключения лихорадки Ку <24>.

--------------------------------

<23> Пункт 1418 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

<24> МУ 3.1.2.3047-13 "Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями".

Целевым аналитом, выявляемым набором реагентов, являются сывороточные антитела класса IgG к антигенам C. burnetii, присутствие которых в сыворотке свидетельствует об инфицированности исследуемого человека возбудителем лихорадки Ку и при наличии клинико-эпидемиологических данных позволяет диагностировать лихорадку Ку. IgG-антитела к C. burnetii сохраняются в течение длительного времени после перенесения заболевания, поэтому их обнаружение при стертой клинической картине является основанием для повторного исследования через 10 - 12 дней. Четырехкратное увеличение титра антител к C. burnetii в "парных сыворотках" указывает на текущую инфекцию, а отсутствие изменения титра антител свидетельствует о перенесенном заболевании в прошлом.

Анализируемые образцы. Исследуемые образцы сыворотки крови хранятся при температуре от 2 °C до 8 °C не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °C не более 1 года. Перед использованием образцы размораживаются при температуре от 16 °C до 25 °C и перемешиваются встряхиванием. Образцы проб сывороток, содержащие агрегаты и осадок, осветляются центрифугированием 10 минут при 6000 об./мин.

Анализируемая сыворотка перед использованием разбавляется в 400 раз, что гарантирует нивелирование действия возможных интерферентов, присутствующих в следовых количествах.

Постановка реакции осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

Титром антител считается наибольшее разведение сыворотки, при котором результаты ИФА оцениваются как положительные. Нарастание титров в 4 и более раз подтверждает наличие текущей коксиеллезной инфекции. В случае отсутствия возможности исследования парных сывороток, обнаружение антител к C. burnetii при значительных разведениях сыворотки (1:3200 и выше) может свидетельствовать о недавно перенесенной лихорадке Ку.

Для выявления антител только к C. burnetii II фазы планшеты сенсибилизируются антигеном штамма коксиелл, который находится в этом фазовом состоянии. Использование гидролизного антигена штамма C. burnetii I фазы, позволяет значительно повысить чувствительность ИФА за счет пространственной демаскировки антигена C. burnetii II фазы при сохранении или даже активации антигена I фазы.

Для лабораторной диагностики случаев острого коксиеллеза исследование сывороток крови больного проводится в первые дни лихорадочного периода болезни. С помощью "ИФА - анти Ку IgG" антитела к C. burnetii выявляются на 5 - 7 день лихорадки. IgM-антитела к C. burnetii выявляются несколько раньше. Для лабораторного подтверждения лихорадки Ку необходимо повторное одновременное исследование "парных сывороток".

Для постановки окончательного диагноза лихорадки Ку применяется комплекс серологических, клинических и эпидемиологических данных.