Приложение 7

к МР 3.1.0281-22

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

C. BURNETII В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

1. Работа по отбору, инкубированию и культивированию РКЭ выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям <30>.

--------------------------------

<30> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

2. Подготовительные работы. Для работы используется свежее оплодотворенное куриное яйцо массой 40 5 г с белой чистой скорлупой. РКЭ при поступлении в лабораторию овоскопируются, отбраковываются нежизнеспособные или имеющие дефекты (трещины) скорлупы эмбрионы.

3. РКЭ, отобранные сотрудниками лаборатории, укладываются на подставки с горизонтальными гнездами величиной 3,5 - 4,0 см тупым концом вверх и помещаются в термостат. Инкубирование проводится в течение 5 - 6 суток при относительной влажности воздуха 60 - 65% и температуре 37 °C. Для заражения используются 6 - 7-суточные РКЭ.

4. В течение всего периода инкубации РКЭ ежедневно овоскопируются и поворачиваются вокруг продольной оси. Термостат проветривается ежедневно в течение 30 - 40 минут.

5. На 2 - 4-е сутки РКЭ овоскопируются для отбраковки погибших и неполноценных эмбрионов. Затем овоскопия проводится 2 раза в сутки.

6. Боксовый блок подготавливается к работе. Готовятся стерильные растворы и питательные среды (мясопептонный агар, мартеновский бульон, тиогликолевая среда). Готовятся дезинфицирующие растворы.

7. Основные работы по заражению РКЭ.

Приготовление взвеси овокультуры живых C. burnetii.

РКЭ заражаются путем введения в желточный мешок инфекционного материала (лиофилизированная культура живых C. burnetii, суспензии из желточных мешков РКЭ, зараженных C. burnetii, и органов биопробных животных). Лиофилизированная культура живых C. burnetii растворяется в расчетном объеме стерильного фосфатного буферного раствора pH 7,2 0,1. Суспензия из желточного мешка готовится из расчета 3 - 5 мл стерильного физиологического раствора на 1 мешок. Из органов морской свинки готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе. Для проведения пассажей заражающая доза подбирается с таким расчетом, чтобы вызвать максимальную гибель эмбрионов на 8 - 9-е сутки после заражения.

Заражение куриных эмбрионов проводится сотрудниками аэрозольной лаборатории. Скорлупа 5 - 6-дневных РКЭ обрабатывается 70%-м этиловым спиртом, место прокола 5%-м спиртовым раствором йода на площади не более чем 0,5 х 0,5 см, который удаляется спиртовым тампоном. Смоченная 96%-м спиртом поверхность яйца обжигается. Скорлупа над воздушной камерой прокалывается стерильным троакаром (смоченный 96%-м спиртом троакар прожигается в пламени спиртовки). Заражение РКЭ проводится с помощью стерильного шприца с иглой среднего калибра длиной 3 - 4 см. Заражение РКЭ по Коксу производится введением суспензии C. burnetii шприцем в полость желточного мешка через воздушную камеру. Яйцо берется левой рукой так, чтобы его тупой конец с отмеченной воздушной камерой был направлен вперед при расположении отметки эмбриона внизу. Через отверстие в скорлупе на глубину 2,5 - 3 см вводится игла шприца и инъецируется жидкость, содержащая C. burnetii в объеме 0,5 мл. Игла вынимается, отверстие в скорлупе герметизируется расплавленным стерильным парафином. После заражения и герметизации на скорлупе делаются карандашом надписи с указанием номера РКЭ, заражающего материала (название штамма, суспензия органов биопробного животного и др.) и даты. По окончании каждого серийного заражения делаются контрольные высевы на стерильность в сахарный бульон.

8. Инкубирование и овоскопия развивающихся куриных эмбрионов. Зараженные РКЭ инкубируются в термостате в условиях, как описано выше, и ежедневно овоскопируются для определения жизнеспособности куриных эмбрионов. Оптимальной для эмбрионов, зараженных C. burnetii, является температура 37 °C.

Эмбрионы, погибшие ранее 3-х суток (травматическая гибель), отбраковываются, помещаются в емкость с дезинфицирующим раствором и обезвреживаются автоклавированием при температуре (132 2) °C в течение 1 часа. При дальнейшей ежедневной овоскопии отбираются для вскрытия погибшие эмбрионы (отсутствие подвижности, сглаженный сосудистый узор) или явно больные (ограниченная подвижность, менее ясный сосудистый узор). Погибшие эмбрионы выдерживаются в течение 24 - 48 часов при температуре культивирования или в условиях постепенного снижения температуры в отключенном термостате.

9. Основные работы при вскрытии РКЭ. Вскрытие развивающихся куриных эмбрионов выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям. Куриные эмбрионы на подложке переносятся из термостата в бокс, предварительно обработанные в предбоксе ватным тампоном, смоченным 70%-м спиртом. Тупой конец яйца, подлежащий вскрытию, обрабатывается спиртом и йодом, как указано выше (заключительное фламбирование). Скорлупа яиц прокалывается профламбированным пинцетом немного выше границы воздушной камеры и циркулярно надламывается на том же уровне. Отделенный фрагмент скорлупы помещается в емкость с дезинфицирующим раствором для эмбрионов. Пинцет помещается в емкость с дезинфицирующим раствором для инструментов.

10. Для дальнейшей работы используются два стерильных профламбированных пинцета. Хорион-аллантоисная оболочка отслаивается пинцетом и удаляется. Эмбрион извлекается пинцетами, отделяется за пупочный канатик. Желточный мешок захватывают пинцетом и избавляются от его содержимого. Оболочка желточного мешка помещается во флакон со стеклянными бусами, предварительно отделяются небольшие кусочки желточной оболочки для приготовления мазка-отпечатка. Флакон закрывается ватно-марлевыми пробками. Для приготовления мазков стерильным пинцетом захватывают небольшой кусочек желточного мешка с хорошо выраженным сосудом, максимально избавляются от примеси желтка, используя стерильную фильтровальную бумагу. Тканевым кусочком наносятся тонкие мазки на поверхность хорошо обезжиренных предметных стекол. На шлифованный край стекла простым карандашом наносится маркировка.

11. Флаконы с желточными оболочками маркируются с указанием штамма C. burnetii, N зараженного эмбриона и даты вскрытия. Флаконы с инфицированными желточными оболочками помещаются в низкотемпературный холодильник и хранятся при температуре минус (70 5) °C до получения результатов контрольных исследований (контроля стерильности желточных оболочек и контроля степени накопления C. burnetii).

12. Контроль стерильности желточных оболочек. Контроль проводится путем посева кусочка ткани желточной оболочки на сахарный мартеновский бульон. Посевы выдерживаются в термостате при температуре (37 1) °C в течение 2 суток. Отсутствие роста посторонней микрофлоры свидетельствует о стерильности посевного материала. Нестерильные желточные оболочки подвергаются автоклавированию при условиях, указанных выше.

13. Контроль степени накопления C. burnetii. Степень накопления C. burnetii проверяется микроскопией мазков, окрашенных методом флуоресцирующих антител, и по методу Здродовского. Приготовленные на стерильных предметных стеклах мазки-отпечатки из кусочка ткани желточного мешка высушиваются на воздухе и фиксируются в ацетоне в течение 20 минут. Окрашиваются по методу Здродовского. Оценка степени накопления C. burnetii проводится визуально, накопление C. burnetii оценивается по общепринятой четырехкрестовой шкале. Для контроля накопления C. burnetii в желточных мешках осуществляется детекция ДНК возбудителя с помощью ПЦР.

Заключительные работы. После завершения работы флаконы с инфицированным материалом помещаются в холодильник, посевы с желточной оболочки переносятся в термостат, проводится текущая дезинфекция боксового блока. Остатки инфицированных куриных эмбрионов выдерживаются в емкости с дезраствором 24 часа с последующим автоклавированием. Рабочая одежда подвергается автоклавированию.