Приложение 6

к МР 3.1.0281-22

ЗАРАЖЕНИЕ МОРСКИХ СВИНОК ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ C. BURNETII

1. Заражение морских свинок выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям <29>. Для заражения животных используется стерильный шприц 10 мл с иглой большого калибра длиной 4 см. Материал для заражения набирается в шприц, после чего конец иглы вводится в стерильный ватик. От попавшего с набираемым в шприц материалом воздуха освобождаются, повернув шприц вертикально вверх иглой, которая предварительно вводится в толщу стерильного ватного тампона, упакованного в сложенный по типу конверта небольшой лист пергаментной бумаги. Игла вкалывается в толщу ватика через складки бумаги, где ее не касались руками. Ватики предотвращают разбрызгивание инфекционного материала из шприца, т.е. распространение ПБА в окружающей среде. Игла, находящаяся в ватике, до момента инъекции остается стерильной. Повернув шприц иглой вверх, из него осторожно выпускаются пузырьки воздуха. Использованный ватик помещается в емкость с дезинфицирующим раствором.

--------------------------------

<29> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.

2. Заражение морских свинок осуществляется введением суспензии, содержащей C. burnetii, шприцем в брюшную полость. Одним из сотрудников фиксируется животное: правой рукой удерживаются задние лапы, левой - передние лапы и голова. Животное удерживается в вертикальном положении головой вниз. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. Другим сотрудником обрабатывается место прокола 70%-ным этиловым спиртом, большим и указательными пальцами левой руки захватывается и оттягивается складка кожи вместе с брюшиной в нижней трети живота. В оттянутую складку кожи вводится игла и осторожно продвигается вглубь. Чувство "провала", исчезновение ощущения сопротивления указывают на проникновение иглы в брюшную полость. После этого вводится содержащийся в шприце заражающий материал в объеме 3 - 5 мл, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки.

3. Термометрия и наблюдение за зараженными морскими свинками. Температура тела животным измеряется в прямой кишке электронным термометром. Перед использованием термометр протирается ватой, смоченной в 70%-м спирте, вытирается насухо и смачивается вазелиновым маслом. Глубина введения термометра должна быть всегда постоянной, так как от этого зависит температура. Измерение температуры в каждой группе животных в течение всего периода наблюдений производится одним термометром в одно и то же время. Одновременно с термометрией проводится наблюдение за скротальной реакцией, которая является внешним проявлением специфического периорхита и иногда орхита. Обращается внимание на наличие гиперемии, отека мошонки и увеличения яичек, которые перестают вправляться в брюшную полость.

4. Подготовка морской свинки к вскрытию. Вскрытие морских свинок проводится сотрудниками в микробиологическом боксе на лабораторном столе из нержавеющей стали или в боксе микробиологической безопасности. Подлежащая вскрытию свинка усыпляется эфиром для наркоза. Усыпленное животное погружается в дезинфицирующий раствор, шерсть обсушивается полотенцем и свинка фиксируется животом вверх на специальной доске для вскрытия с приспособлением для фиксации конечностей. Шерсть в области брюшка, мошонки, паха и затылка тщательно удаляется (выщипывается или бреется).

5. Передняя поверхность тела свинки перед вскрытием для удаления остатка волос смачивается 96%-м спиртом и поджигается (завершающее фламбирование). После этого начинается собственно вскрытие по схеме:

1) наружный осмотр;

2) разрезы, отделение покровов, вскрытие полостей и внутренний осмотр положения органов и состояния полостей;

3) взятие внутренних органов для исследования;

4) взятие головного мозга.

6. Разрез кожи производится по белой линии от лонной кости (симфиза) до шеи. Чтобы не прорезать брюшину, пинцетом, находящемся в левой руке, приподнимается кожа и делается сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза. Одна бранша ножниц вставляется в образовавшееся отверстие, разрезается кожа до шеи животного, после чего кожа разрезается по направлению к каждой из четырех конечностей. Концом закрытых ножниц кожа препарируется, открывая ее лоскуты вправо и влево. Лоскуты кожи фиксируются корнцангами за верхние и нижние углы. Наружный листок брюшины обрабатывается ватным тампоном, смоченным 70%-м спиртом.

7. Яички оказываются в основании кожного треугольника. Для взятия яичек пинцетом Кохера захватывается за вершину треугольный лоскут кожи и оттягивается вниз. Обнажаются яички, покрытые влагалищными оболочками. Если обнажение не удается сразу, яички высвобождаются из рыхлой клетчатки концом закрытых ножниц при оттягивании кожного лоскута пинцетом Кохера. Освобожденные яички захватываются хирургическим пинцетом, отрезаются ножницами от жирового придатка и переносятся в 2 пробирки: в стерильную - для пассирования на биологических моделях, в пробирку с 70%-м спиртом - для исследования в ПЦР. Небольшим кусочком ткани органа делаются мазки-отпечатки для микроскопии.

8. После замены инструментов вскрывается брюшная полость. Производится разрез брюшной стенки под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кости. Треугольники брюшной стенки отводятся в стороны и фиксируются корнцангами. В качестве материала, содержащего C. burnetii, наибольший интерес представляют легкие, печень и другие органы. У морских свинок селезенка имеет плоскую форму, размещается дорсолатеральнее желудка, с которым связана короткой брыжейкой. Ее длина составляет 2,5 - 3 см, ширина - 0,8 - 1 см.

9. Грудная полость вскрывается, после поднятия мечевидного отростка пинцетом, ребра перерезаются ножницами в области хрящей. Осматривается грудная полость и при наличии в органах изменений описывается их картина. При наличии патологоанатомических изменений в легких, фрагменты органа берутся для дальнейшего пассирования, делаются мазки-отпечатки.

10. Вскрытие черепа выполняют, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы. Кожа головы и шеи обрабатывается 96%-м спиртом и поджигается (завершающее фламбирование). Разрез кожи производится перпендикулярно оси тела за ушами, продолжается слева и справа вперед к глазницам. Кожа вместе с ушами отпрепаровывается и отбрасывается вперед, оголяя черепную коробку. Одна бранша ножниц вставляется в большое черепное отверстие и кости черепа разрезаются влево и вправо по направлению к глазницам. Открывается надрезанная часть черепной коробки. Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекается из основания черепа, поднимается слегка раздвинутыми браншами ножниц, подрезаются черепно-мозговые нервы.

11. Все извлеченные органы делятся на части: основная (большая по размеру) помещается в стерильные пробирки для дальнейших пассажей, небольшие фрагменты органов помещаются в пробирки с 70%-м спиртом, производятся мазки-отпечатки для световой и люминесцентной микроскопии.

12. Контроль степени накопления C. burnetii. Степень накопления C. burnetii проверяется с помощью микроскопии мазков, окрашенных методом флуоресцирующих антител и по методу Здродовского. Приготовленные на стерильных предметных стеклах мазки-отпечатки из кусочков тканей органов высушиваются на воздухе и фиксируются в ацетоне в течение 20 минут. Окрашиваются по методу Здродовского. Оценка степени накопления C. burnetii проводится визуально, накопление C. burnetii оценивается по общепринятой четырехкрестовой шкале. Для люминесцентной микроскопии применяется реакция непрямой иммунофлуоресценции. Для контроля накопления C. burnetii в тканях органов осуществляется детекция ДНК возбудителя в ПЦР.

Заключительные работы. После завершения работы флаконы с органами животных помещаются в холодильник, проводится текущая дезинфекция боксового блока. Остатки инфицированного материала выдерживаются в емкости с дезраствором 24 часа с последующим автоклавированием. Рабочая одежда подвергается автоклавированию.