2.3. Лабораторные диагностические исследования

- Рекомендуется подтверждающая молекулярная диагностика ВА и синдрома WAGR обязательная для больных ВА и включает несколько этапов в соответствии с разработанным алгоритмом, представленным в медицинской технологии [43] и патенте RUS 2641254 от 18.08.2017, зарегистрированном в Федеральной службе по интеллектуальной собственности РФ [44] (Рис. 1).

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентов, собранной в пробирку с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой), проводится по одному из стандартных протоколов очистки ДНК. Для анализа родительского мозаицизма по обнаруженной у пробанда мутации используются образцы мочи и буккального эпителия. Для проведения кариотипирования и in situ гибридизации (FISH) из крови, собранной в пробирку с гепарином натрия**, готовится суспензия ядер.

- Рекомендуется 1 этап - проведение анализа копийности генов в локусе 11p13 с помощью реакции лигазозависимой амплификации зондов (MLPA анализ) [43, 44].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: В случае обнаружения крупных делеций, для валидации выполняется генотипирование отягощенных семей по нескольким микросателлитным маркерам хромосомы 11.

В случае обнаружения крупных делеций, затрагивающих ген WT1, проводится флуоресцентная in situ гибридизация FISH с зондом, специфичным к гену WT1, для валидации гемизиготного состояния локуса у пробанда. Таким пациентам выставляется предположительный диагноз WAGR синдрома и даются рекомендации постоянного наблюдения у онколога до 8 лет.

У пробандов с обнаруженными крупными хромосомными делециями обязательно проводится кариотипирование для установления причины хромосомного дисбаланса: простая интерстициальная делеция 11p13 или же хромосомная инверсия или транслокация. Если произошла транслокация, то необходим также анализ кариотипа родителей.

Рекомендуется 2 этап - в случае отсутствия крупных структурных изменений локуса 11p13 у пробанда, прямым секвенированием по Сэнгеру определяются толковые изменения гена PAX6 [43, 44].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: Далее мутация пробанда определяется у больных членов семьи, если имеется семейная история. В случае, когда очевидной истории нет, необходимо подтвердить статус мутации de novo доказательством отсутствия мутации пробанда у родителей, а также подтвердить биологическое родительство. На этом же этапе проводится анализ возможного соматического мозаицизма у родителей, что важно для оценки риска прогноза для последующего потомства.

Проводится подтверждение патогенности впервые найденных внутригенных мутаций в гене PAX6 с помощью анализирующих предсказательных программ, доказательства отсутствия данного изменения в выборке здоровых людей и/или у здоровых членов семьи, и, в случае необходимости, функционального анализа.

Все внутригенные мутации получают название в соответствии с транскрипционным вариантом 1 PAX6 (NM 000280.4). Границы делеций называются в соответствии с положением MLPA проб с уменьшенным сигналом.