2.1.8.23. Общий холестерин в маслах с полиненасыщенными жирными омега-3 кислотами (201080023-2022)

Испытание может быть использовано для количественного определения общего содержания свободного и этерифицированного холестерина в лекарственных средствах животного происхождения с различной концентрацией омега-3 кислот. Холестерин в маслах с полиненасыщенными жирными омега-3 кислоты присутствует в продуктах из рыбьего жира, жира печени рыб.

Для количественного определения свободного и этерифицированного холестерина применяют метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией (2.1.2.27).

Основной раствор внутреннего стандарта. 0,15 г P растворяют в гептане P и доводят объем тем же растворителем до 50,0 мл. Допускается хранение раствора внутреннего стандарта в морозильной камере до 6 месяцев.

Рабочий раствор внутреннего стандарта. Готовят непосредственно перед использованием. 1,0 мл основного раствора внутреннего стандарта доводят гептаном P до объема 10,0 мл.

Основной раствор холестерина. 50,0 мг холестерола P растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем. Основной раствор может храниться в морозильной камере до 6 месяцев.

Рабочий раствор холестерина. Готовят непосредственно перед использованием. 1,0 мл основного раствора холестерина растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 10,0 мл тем же растворителем.

Основной раствор холестерина и . 50,0 мг холестерина P и 50,0 мг P растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 3 месяцев.

Раствор сравнения. Готовят раствор в день использования. 1,0 мл основного раствора холестерина и растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем.

Калибровочные растворы. Готовят растворы в день использования. Навеску для каждого калибровочного раствора, согласно данным таблицы 2.1.8.23.-1, доводят 10% (об/об) раствором этилацетата P в гептане P до объема 20,0 мл.

Таблица 2.1.8.23.-1. - Подготовка калибровочных растворов

--------------------------------

<*> Из расчета навески в 0,100 г испытуемого образца.

При высоком содержании холестерина (от 3,0 до 20,0 мг/г) используют все 5 калибровочных растворов.

При низком содержании холестерина (от 0,2 до 3,0 мг/г) используют калибровочные растворы: 0,2 мг/г, 1,0 мг/г и 3,0 мг/г.

Испытуемый раствор. 0,100 г испытуемого образца субстанции помещают в термостойкую кварцевую пробирку на 15 мл (если образец имеет неоднородную консистенцию, то перед взвешиванием его энергично встряхивают в подходящей емкости, отстаивают от 10 мин до 15 мин, удерживая емкость в вертикальном положении, для взвешивания отбирают часть из среднего слоя).

В пробирку с навеской испытуемого образца добавляют 1,0 мл рабочего раствора внутреннего стандарта. Содержимое пробирки упаривают досуха при температуре 50 °C и пропускании через раствор слабого потока азота P. Добавляют 0,5 мл 50% раствора (м/м) калия гидроксида P и 3,0 мл этанола (96%) P. Наполняют пробирку азотам P, закрывают пробкой и гомогенизируют при 100 °C в течение 1 ч. Охлаждают в течение 10 минут, добавляют 6,0 мл воды дистиллированной P и гомогенизируют, получая гомогенную смесь с омыленным веществом.

Кондиционируют колонку для твердофазной экстракции (ТФЭ) (приводят сорбент в активное состояние).

Колонка объемом 20 мл, содержит 1 г силикагеля октадецилсилильного эндкепированного для хроматографии P (частицы диаметром 55 мкм и размером пор 7 нм) и 5 мл 50% (об/об) раствора этанола (96%) P в воде дистиллированной P.

Вносят 5,0 мл гомогенной смеси в колонку ТФЭ, следя за тем, чтобы колонка была постоянно влажной. Промывают колонку 5,0 мл 50% (об/об) этанола (96%) P в воде дистиллированной P. Элюирование проводят, используя 20,0 мл 10% (об/об) раствора этилацетата P в гептане P. Полученный элюат используют в качестве испытуемого раствора.

Условия хроматографирования:

- колонка: капиллярная из термостойкого кварца длиной 15 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая фенил(5)метил(95)полисилоксаном P толщиной 0,25 мкм;

- газ-носитель: гелий для хроматографии P;

- давление: 48 кПа (соответствует скорости газа-носителя примерно 0,6 мл/мин при 200 °C и примерно 0,4 мл/мин при 330 °C);

- деление потока: 1:5;

- режим изменения температуры:

До начала испытания колонку прогревают до 340 °C не менее 30 мин при указанном давлении;

- детектор: пламенно-ионизационный;

- объем вводимой пробы: 1 мкл;

- время удержания: около 7,5 мин, холестерина около 9 мин;

- калибровочная кривая: строят калибровочную кривую, отмечая по оси абсцисс (ось x) номинальную концентрацию холестерина в каждом из калибровочных растворов в миллиграммах на грамм, по оси ординат (ось y) отмечаем отношение площади пика холестерина (A₁) к площади пика (A₂) на хроматограмме, полученной от каждого из калибровочных растворов. Рассчитывают наклон (S) и пересечение с осью ординат (ось y).

Пригодность хроматографической системы:

- разрешение: не менее 1,5, между пиками холестерина и на хроматограмме раствора сравнения;

- коэффициент детерминации (R²) калибровочной кривой составляет не менее 0,995.

Содержание общего холестерина в испытуемом веществе (в миллиграммах на грамм) рассчитывают по формуле:

,

где: A₁ - площадь пика холестерина на хроматограмме испытуемого раствора;

A₂ - площадь пика на хроматограмме испытуемого раствора;

m₁ - навеска субстанции в испытуемом растворе в граммах;

y - пересечение калибровочной кривой с осью ординат (ось y);

S - наклон калибровочной кривой, в граммах на миллиграмм.

201080024-2022