МЕТОД 2

Данный метод (обычно называемый методом количественного определения белка Лоури) основан на восстановлении белком фосфрономолибденово-вольфрамового смешанного кислого хромогена в фосфорономолибдено-вовольфрамовом реактиве, что приводит к появлению максимума поглощения при длине волны 750 нм. Фосфорномолибденово-вольфрамовый реактив взаимодействует преимущественно с остатками тирозина. Окрашивание достигает максимума через 20 - 30 мин при комнатной температуре, после чего происходит постепенное обесцвечивание. Поскольку данный метод является чувствительным к мешающим веществам, можно использовать методику осаждения белка из испытуемого образца. Большинство мешающих веществ вызывают ослабление окрашивания, но применение некоторых детергентов может вызывать усиление окраски. Высокая концентрация соли может привести к образованию осадка. Поскольку разные виды белков могут давать различные по интенсивности окраски, стандартный образец и испытуемый белок должны быть одинаковыми. Перед приготовлением испытуемого раствора, при необходимости, отделяют мешающие вещества от белка в испытуемом образце по описанной ниже методике. Влияние мешающих веществ может быть минимизировано путем разведения, обеспечивающего концентрацию испытуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную P.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого образца в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье, с концентрацией белков в пределах интервала концентраций калибровочной кривой. Соответствующий буферный раствор обеспечивает значение pH испытуемого раствора от 10,0 до 10,5.

Растворы сравнения. Готовят раствор соответствующего стандартного образца белка в буферном растворе, указанном в частной фармакопейной статье. Порции полученного раствора разводят тем же буферном раствором для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале от 5 мкг/мл до 100 мкг/мл.

Контрольный раствор. Буферный раствор, используемый для приготовления испытуемого раствора и растворов сравнения.

Меди сульфата реактив. 100 мг меди (II) сульфата P и 0,2 г натрия тартрата P растворяют в воде дистиллированной P и доводят до объема раствора тем же растворителем до 50 мл. 10 г натрия карбоната безводного P растворяют в воде дистиллированной P и доводят объем раствора тем же растворителем до 50 мл. В раствор меди сульфата медленно при перемешивании вливают раствор натрия карбоната. Раствор используют в течение 24 ч.

Меди реактив щелочной. Смесь меди сульфата реактив - раствор 50 г/л натрия додецилсульфата P - раствор 32 г/л натрия гидроксида P (1:2:1 об/об). Хранят при комнатной температуре и используют в течение двух недель.

Фосфорномолибденово-вольфрамовый реактив разбавленный. Смешивают 5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива P и 55 мл воды дистиллированной P. Хранят в контейнере из темного стекла при комнатной температуре.

Методика. К 1,0 мл каждого раствора сравнения, испытуемого раствора и контрольного раствора прибавляют по 1,0 мл меди реактива щелочного и перемешивают. Выдерживают в течение 10 мин. Прибавляют 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива разбавленного, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Измеряют оптические плотности (2.1.2.24) растворов при длине волны 750 нм, используя контрольный раствор в качестве компенсационного раствора.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной; однако, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочной кривой, небольшой, она приближается к линейной. Строят график зависимости оптических плотностей растворов сравнения от концентраций белка и, используя линейную регрессию, строят калибровочную кривую. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Мешающие вещества. В представленной методике до проведения испытания мешающие вещества удаляют путем осаждения белков при добавлении к раствору испытуемого образца дезоксихолаттрихлоруксусной кислоты. Данная методика также может быть применена для концентрирования белков из разбавленного раствора.

0,1 мл раствора 1,5 г/л натрия дезоксихолата P прибавляют к 1 мл раствора испытуемого образца, перемешивают на вихревом встряхивателе и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Прибавляют 0,1 мл раствора 720 г/л трихлоруксусной кислоты P и перемешивают на вихревом встряхивателе. Центрифугируют при ускорении 3000 g в течение 30 мин, декантируют и удаляют оставшуюся жидкость пипеткой. Полученный осадок белка растворяют в 1 мл меди реактива щелочного.