5. ЭТАПЫ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИК И ИХ ВАЛИДАЦИЯ

В данном разделе представлены способы оценки исполнения метода в целом, при его разработке. Степень разработки метода и аналитическая валидация выбирается на основе их пригодности для определенного продукта. В зависимости от выбранного метода, для анализа гликанов необходимы определенные действия, например как:

- выделение и очистка (или деминерализация) гликопротеина;

- ферментативная (или химическая) обработка гликопротеина с целью избирательного отщепления от "опорного" белка только N- или только O-связанных гликанов;

- выделение и очистка отщепленных гликанов;

- контроль отщепленной сиаловой кислоты и моносахаридных остатков;

- хромофорное мечение отщепленных гликанов;

- разделение гликанов, нативных или флуоресцентно-меченных;

- идентификация и количественное определение гликанов (например, вычисление Z числа);

- определение положений связывания на основании относительных количеств гликозилированных и негликозилированных пептидов.

Выделение и очистка белков. Для удаления мешающих веществ (например, вспомогательные вещества, соли) могут понадобиться выделение и очистка гликопротеинов из матрицы, что при необходимости, описывают в частной фармакопейной статье. Методики очистки должны быть валидированы на предмет воспроизводимости, чтобы гарантировать постоянство количественной открываемости белка.

Отщепление и выделение олигосахаридов. Подход, выбранный для отщепления гликанов, зависит от анализируемых белков и основан на типе гликозилирования, т.е. N- или O-связанное гликозилирование. Применение не указанных в фармакопее методов отщепления гликанов возможно только после оптимизации этих методов с целью подтверждения количественного профилирования всех гликановых частей молекулы. Оптимизированы должны быть все факторы, которые обладают существенным влиянием на эффективность отщепления, например: относительная концентрация фермент/белок, температура, течение реакции во времени, денатурирование белка до начала отщепления.

Следует отметить, что ферментативная/химическая реакция не должна изменять строение гликана, например, не должна разрушать остатки сиаловой кислоты. Там, где присутствует более одного положения гликозилирования, при ферментативной обработке должны пропорционально отщепляться все фрагменты олигосахаридов, присоединенные к белку, независимо от их структуры и своего конкретного места в белке. Должна быть подтверждена открываемость всех гликановых составляющих из реакционной смеси.

Дериватизация отщепленных гликанов. Дериватизацию обычно выполняют в соответствии с методиками, не описанными в фармакопее. По этой причине повторная дериватизация всех гликановых групп должна верифицироваться, что может быть достигнуть при оптимизации условий реакций, таких как количество реактивов дериватизации, температура и время реакции. Реакция дериватизации не должна изменять строение гликана, например не должна разрушать остаток сиаловой кислоты.

Разделение, идентификация и проверка пригодности системы. Методы, применяемые для анализа гликанов, должны быть способны детектировать и разделять различные гликановые части молекулы, обеспечивая надежную идентификацию и количественный анализ гликанов.

Критерии приемлемости для проверки пригодности системы, а также расщепления, открываемости и анализа гликанов, зависят от критических параметров испытания, которые влияют на конечный результат.

Сравнение гликановых профилей испытуемого образца и стандартного образца, полученных в одинаковых условиях, является параметром для оценки правильности выполнения аналитической методики. Для дальнейшего подтверждения полученных результатов, анализы могут быть повторно проведены с помощью независимого метода. Использование стандартного образца (например, стандартный образец испытуемого вещества, маркер гликана для проверки пригодности системы) является необходимым для установления параметров пригодности системы и валидации аналитической методики.

Воспроизводимость результатов количественного определения (например, расчет Z числа) гликана должна быть подтверждена.

Определение положений связывания, на основании относительных количеств гликозилированных и негликозилированных пептидов. В том случае, если степень гликозилирования оценивается путем сравнения содержания гликозилированных и негликозилированных пептидов после ферментативного расщепления, должна быть доказана воспроизводимость отщепления для обеих форм пептида.