2.1.2.39. Пептидное картирование (201020039-2019)

Пептидное картирование представляет собой метод идентификации белков, особенно получаемых методом рекомбинантных ДНК. Метод включает химическое или ферментативное расщепление белков до образования пептидных фрагментов с последующим их разделением и идентификацией воспроизводимым способом. Это надежный метод испытания, позволяющий идентифицировать замену практически любой отдельной аминокислоты, произошедшей вследствие ошибок при транскрипции комплементарной ДНК (кДНК), или точечных мутаций. Пептидное картирование представляет собой процедуру сравнения, поскольку сравнение полученной информации с обработанным таким же образом стандартным образцом позволяет подтвердить первичную структуру белка, определить возможные изменения первичной структуры в случае наличия таковых, подтвердить соответствие процесса и генетическую стабильность. Каждый белок обладает уникальными характеристиками, которые должны быть хорошо изучены, чтобы научные и аналитические подходы позволяли валидировать разработку пептидной карты, обеспечивающей достаточную специфичность.

Данный раздел содержит детальное описание аспектов использования и валидации метода пептидного картирования с целью получения характеристики анализируемого белка, оценки стабильности клеточных систем экспрессии, используемых для получения продуктов рекомбинантных ДНК и оценки согласованности процесса в целом - в отношении как оценки стабильности продукта, так и обеспечения идентичности белка, либо определения содержания протеинов с изменениями в структуре.

Пептидное картирование не является общим методом, а заключается в составлении индивидуальных карт для каждого отдельного белка. Хотя технологии продолжают стремительно развиваться, существует ряд методов, которые являются общепризнанными. При наличии определенных расхождений с данными методами они будут описываться в соответствующих частных фармакопейных статьях.

Составление пептидных карт может рассматриваться как метод получения "отпечатков пальцев" белка и представляет собой получаемую в результате ряда химических процессов полную расшифровку анализируемого белка. Метод включает четыре принципиальные стадии: выделение и очистка белка - в случае, если белок входит в состав какой-либо смеси; избирательное расщепление пептидных связей; хроматографическое разделение образующихся пептидных фрагментов; анализ и идентификация пептидов. Анализируемый образец подвергается расщеплению и анализу параллельно со стандартным образцом. Полное расщепление пептидных связей более вероятно, когда вместо химических гидролизующих реагентов используются такие ферменты, как эндопептидазы (например, трипсин). Для того, чтобы карта была информативной, она должна содержать достаточное количество пептидов. С другой стороны, в случае, если пептидных фрагментов будет слишком много, карта может утратить свою специфичность, поскольку у многих белков может оказаться аналогичный профиль.