1. Забор материала для иммунологической диагностики

1.1. Материал для исследования. Для иммунологического исследования на наличие антител к хантавирусам используется сыворотка крови (как основной метод) и моча (как дополнительный метод). Для определения антигенов хантавирусов в тканях человека (материалах аутопсии) можно исследовать суспензии органов (почки, печень, легкие, селезенка).

1.2. Методы исследования. Основные - ИФА, МФА.

1.3. Период забора материала. Первый забор крови - при обращении больного за медицинской помощью (желательно до 4 - 7 дней болезни), параллельно забирают мочу (1,0 мл). Повторный забор крови и мочи проводят через 2 - 3 дня.

При отсутствии антител во втором образце, но сохранении подозрения на ГЛПС, рекомендуется произвести забор третьего образца крови у пациента через 2 - 3 дня после второго.

Кусочки органов забирают при проведении аутопсии. Отбор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного.

1.4. Методика забора материала. Забор крови производят натощак или не менее чем через 3 часа после приема пищи из вены с помощью вакуумной системы для забора крови типа "Vacuett" в пробирку с активатором сгустка. Пробирку аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь перемешалась с реагентом. При отсутствии пробирок с реагентами возможен забор крови одноразовым шприцем с иглой диаметром 0,8 - 1,1 мм в стерильную пробирку без реагента, герметично закрывающуюся.

Мочу собирают в стерильный пластиковый контейнер объемом 30 - 50 мл. Для исследования необходима средняя порция утренней мочи.

Секционный материал. Отбирают кусочки тканей почек, печени, легких, селезенки. Забор проб проводят из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Кусочки материала объемом не более 1 x 1 x 1 см помещают о одноразовые стерильные контейнеры (емкости) с плотно завинчивающимися крышками.

1.5. Предобработка проб. Для получения сыворотки пробирку с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. Сыворотку переносят с помощью автоматического дозатора отдельным наконечником с фильтром (или пастеровской пипеткой) в стерильную пробирку. Сыворотка не должна быть гемолизированной.

Образец мочи объемом 1,0 мл центрифугируют в пробирке типа "Эппендорф" при 8000 об/мин в течение 10 мин. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле:

g = 0,00001118 * r * (об/мин)²,

где r - радиус ротора центрифуги в мм.

Осторожно удаляют 0,9 мл верхней части надосадочной жидкости в емкость с дезинфицирующим раствором. Осадок ресуспендируют в оставшихся 100 мкл надосадочной жидкости и используют (в неразведенном виде) для выявления специфических антител к хантавирусам.

Кусочки органов растирают в стерильных фарфоровых ступках или с помощью гомогенизатора и готовят 10%-ю суспензию в стерильном 0,9%-м растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 секунд. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ. Супернатант используют для постановки ИФА.