9.3. Лабораторное исследование материала от людей

9.3.1. Проводится для подтверждения (или исключения) клинического диагноза у больных, а также умерших лиц при подозрении на ГЛПС либо умерших от лихорадки неясного генеза на эндемичных по ГЛПС территориях. Совокупность клинических симптомов, данных эпидемиологического анамнеза и результатов лабораторного исследования позволяет поставить окончательный диагноз ГЛПС.

9.3.2. Материалом для исследования являются: кровь, сыворотка крови, плазма крови, моча, суспензии органов, взятых при аутопсии (почки, печень, легкие, селезенка).

9.3.3. Забор материала производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами (см. п. 9.2.2).

9.3.4. Отбор материала и его упаковку производят медицинские работники медицинских организаций (например, стационара, в который госпитализирован больной), а при патологоанатомическом исследовании трупов умерших - патологоанатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы).

9.3.5. Для выявления антител к возбудителям ГЛПС в сыворотке крови больных используют МФА, ИФА. С помощью этих методов могут быть выявлены либо суммарные специфические антитела, либо антитела классов M и G.

Подтверждение клинического диагноза ГЛПС проводят путем определения антител классов M и G к возбудителям этого заболевания с помощью ИФА. Определение IgM к хантавирусам позволяет проводить лабораторную диагностику ГЛПС начиная с 2 - 5-х суток после начала заболевания. Максимальная концентрация специфических IgM отмечается на 6 - 11-й день после появления первых симптомов болезни. Позднее титры IgM начинают снижаться. К концу третьего месяца от начала заболевания IgM обычно не обнаруживаются. В редких случаях возможно выявление специфических IgM в течение 1 - 3 лет после перенесения ГЛПС.

При типичном течении ГЛПС IgG к хантавирусам достигают уровня, регистрируемого с помощью диагностических препаратов наиболее часто к 3 - 4-у дню заболевания. Значительное повышение титров IgG отмечается на 2 - 3-й неделе заболевания и достигает максимума к 4-й неделе. Низкоавидные антитела класса G присутствуют до 1 - 2 месяцев после начала заболевания. Антитела класса G, выявляемые позднее, характеризуются как высокоавидные. Специфические IgG при ГЛПС могут быть обнаружены в течение многих лет после перенесения заболевания, возможно, пожизненно. Выявление антител этого класса указывает на контакт с хантавирусами (на текущую или перенесенную ранее инфекцию).

Сыворотки крови, взятые от больных в остром периоде заболевания, не могут быть использованы для определения видовой принадлежности хантавирусов, так как нейтрализующие антитела в этот период часто дают перекрестные реакции.

При анализе парных сывороток для получения результатов, адекватно отражающих изменение концентраций антител к хантавирусам в крови, необходимо использовать наборы реагентов одного предприятия-изготовителя.

Выявление IgM свидетельствует о наличии острой инфекции. Отсутствие IgM к хантавирусам в первой сыворотке не означает, что пациент не инфицирован возбудителем. Если кровь взята у больного в начале острого периода заболевания, IgM в сыворотке крови могут отсутствовать или присутствовать в концентрации, недостаточной для выявления используемыми диагностическими тест-системами. Отсутствие иммуноглобулинов класса G к хантавирусам в первой сыворотке не означает, что пациент не инфицирован хантавирусами, они могут отсутствовать в начале острого периода заболевания. Диагностически значимым результатом является 4-кратное и более увеличение титра антител класса G в образцах парных сывороток. Па ранних сроках болезни чувствительность метода ИФА может быть несколько ниже метода МФА.

При выявлении с помощью МФА суммарно IgM и IgG антител к хантавирусам в сыворотках крови людей диагностически значимым является регистрация 4-кратного и более нарастания их титра в парных сыворотках. Суммарные антитела к хантавирусам выявляют МФА в сыворотках крови больных ГЛПС начиная со 2 - 3-го дня болезни. С 1 по 4 день болезни антитела к вирусу Пуумала обнаруживаются в 92% случаев, с 5 по 7 день - в 95,7% случаев, с 8 дня - в 100%.

Одновременное обнаружение хантавирусных антител МФА в крови и моче лихорадящих больных является достоверным диагностическим критерием острого периода хантавирусной инфекции и позволяет установить специфический диагноз на 3-й, 4-й, 5-й, 6-й день от начала заболевания в 85,7%, 89,4%, 93,1% и 100% случаев соответственно, ие прибегая к исследованию антител в парных сыворотках крови.

Для повышения эффективности серодиагностики ГЛПС необходим наиболее ранний забор первой сыворотки (желательно до 4 - 5-го дней болезни) при поступлении больного в стационар или при обращении в поликлинику, повторный забор крови производят через 2 - 3 дня. При взятии первой сыворотки позже 8-го дня болезни нарастание титра антител может не выявляться.

При отсутствии антител в первом образце, но сохранении подозрения на ГЛПС, рекомендуется провести забор второго образца крови у пациента через 2 - 3 дня после первого. Отсутствие выявления специфических антител спустя 8 - 9 дней после начала заболевания свидетельствует против хантавирусной этиологии болезни.

При обследовании больных с явными клиническими проявлениями ГЛПС и характерным эпидемиологический анамнезом в 1 - 2% случаев антитела к возбудителям ГЛПС не выявляются, что может свидетельствовать о наличии серонегативных форм заболевания, которые являются следствием тех или иных нарушений гуморального звена иммунитета у отдельных людей.

Определение антигенов хантавирусов в тканях человека (материалах аутопсии), а также в органах мелких млекопитающих проводят методом ИФА с использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов.

9.3.6. Молекулярно-биологические методы (ОТ-ПЦР, РТ-ПЦР) применяются для выявления РНК возбудителей ГЛПС в крови (плазме, сыворотке крови), моче, суспензиях органов, взятых при аутопсии (почки, печень, легкие, селезенка). Для проведения ПЦР забор крови проводят в ранний период болезни (в период вирусемии) не позднее 5 дня от начала заболевания. Забор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного. При наличии соответствующего оснащения проводят изучение нуклеотидных последовательностей к ДНК вируса методом секвенирования.

9.3.7. Вирусы - возбудители ГЛПС могут быть изолированы из крови, плазмы, сгустка крови, суспензий органов, взятых при аутопсии (почки, печень, легкие, селезенка). Кровь для вирусологического исследования забирают в ранний период болезни (до 5 дня от начала заболевания), то есть в период вирусемии. Забор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного. Выделение и идентификация хантавирусов - длительный, трудоемкий метод, требующий наличия условий специализированной лаборатории, в основном используется в научных целях для изучения циркулирующих на территории хантавирусов.

9.3.8. Оценка результатов лабораторных исследований клинического материала.

Клинический диагноз ГЛПС считают подтвержденным в следующих случаях:

- обнаружение с помощью МФА суммарных антител (IgM и IgG) к возбудителям ГЛПС одновременно в сыворотке крови и в моче;

- выявление 4-кратного и более увеличения титра антител в парных сыворотках крови, взятых с интервалом 2 - 3 дня (обе пробы сывороток крови исследуют одновременно в одном опыте);

- выявление IgM к возбудителям ГЛПС в сыворотке крови в острый период заболевания в совокупности с выявлением IgM и/или IgG в парной сыворотке;

- выявление 4-кратного и более увеличения титра IgG к возбудителям ГЛПС в парных сыворотках;

- обнаружение в исследуемых образцах специфического фрагмента РНК хантавирусов - возбудителей ГЛПС;

- выделение хантавирусов - возбудителей ГЛПС.