2. Забор материала для молекулярно-биологического исследования

2.1. Материал для исследования.

Материалом для исследования служат образцы цельной крови, сыворотки и/или плазмы крови, мочи, пробы секционного материала (почки, печень, легкие, селезенка).

2.2. Методы исследования.

Основные - ОТ-ПЦР, РТ-ПЦР, секвенирование.

2.3. Период забора материала.

Кровь забирают при обращении больного за медицинской помощью (желательно не позднее 5-го дня от начала заболевания). Мочу забирают в острый период заболевания. Кусочки органов забирают при проведении аутопсии. Отбор секционного материала необходимо произвести как можно быстрее после смерти больного.

2.4. Методика забора материала.

Кровь для получения сыворотки или плазмы для исследования методами ОТ-ПЦР или РТ-ПЦР забирают, как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

Для исследования цельной крови и плазмы кровь забирают натощак или не менее чем через 3 часа после приема пищи из вены с помощью вакуумной системы для забора крови типа "Vacuett" в пробирку с антикоагулянтом (с ЭДТА или с раствором натрия цитрата. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!). Пробирку аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь перемешалась с реагентом.

Мочу собирают в стерильный пластиковый контейнер объемом 30 - 50 мл. Для исследования необходима средняя порция утренней мочи.

Секционный материал забирают, как указано в п. 1.4 приложения 5 к настоящим МУ.

2.5. Предобработка проб. Для получения сыворотки кровь обрабатывают, как указано в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.

Для работы с цельной кровью переносят необходимый объем материала с помощью автоматического дозатора отдельным наконечником с фильтром (или пастеровской пипеткой) в пробирку объемом 1,5 мл.

Для получения плазмы пробирку с кровью центрифугируют в течение 10 минут при величине центробежного ускорения g, соответствующей скорости вращения 2000 об/мин. Величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.

После центрифугирования плазму крови отбирают в пробирку объемом 1,5 мл.

Моча. При наличии центрифуги с охлаждением до плюс 4 °C для центрифужных пробирок типа "Фалькон" объемом 50 мл и ускорением 10000 об/мин образец мочи в объеме 10,0 мл центрифугируют при g, соответствующей 10000 об/мин, в течение 10 мин (величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ). После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок и 1 мл надосадочной жидкости над ним переносят в пробирку типа "Эппендорф". Затем снова концентрируют пробу при g, соответствующей 10000 об/мин, в течение 10 мин (величина центробежного ускорения g для используемой центрифуги рассчитывается по формуле, представленной в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ). Верхнюю часть надосадочной жидкости удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок ресуспендируют в нижней части надосадочной жидкости (100 - 200 мкл) и используют для экстракции РНК. Для экстракции РНК, в случае наличия большого количества солей, в отдельную пробирку типа "Эппендорф" переносят нижнюю часть надосадочной жидкости и используют ее для исследования. При отсутствии центрифуги с указанными выше параметрами проводят концентрирование только из 1 мл мочи, как описано выше. Экстракцию РНК также проводят из осадка и нижней части надосадочной жидкости.

Кусочки органов подготавливают, как указано в п. 1.5 приложения 5 к настоящим МУ.