3.2. Система банков клеток

Для синтеза рекомбинантных белков необходимо использовать только надлежащим образом охарактеризованные ГБК и РБК. Банк клеток представляет собой комплект хранящихся в определенных условиях контейнеров одинакового состава, каждый из которых содержит аликвоту, отобранную из одного и того же пула клеток. ГБК обычно получают из отобранного клона клеток, содержащего экспрессирующую конструкцию. РБК получают, культивируя клетки из одного или нескольких контейнеров ГБК. В регистрационном досье необходимо подробно описать процесс получения клеточной линии и формирования банка клеток, включая методы и реагенты, применявшиеся при культивировании, клеточный возраст in vitro и условия хранения. Во всех банках клеток должно быть определено наличие значимых генотипических и фенотипических маркеров, которые могут включать экспрессию рекомбинантного белка и наличие экспрессирующей конструкции.

Экспрессирующую конструкцию в ГБК следует анализировать согласно приведенной ниже последовательности испытаний. Если такой анализ на ГБК провести невозможно, его необходимо выполнить на каждом из рабочих банков.

Для определения числа копий экспрессирующей конструкции, выявления в ней инсерций или делеций, а также для установления числа участков интеграции следует применять картирование с использованием рестрикционных эндонуклеаз или другие подходящие методы. Для внехромосомных экспрессирующих систем следует определить процент клеток хозяина, сохраняющих экспрессирующую конструкцию.

Необходимо подтвердить (верифицировать) правильность последовательности экспрессирующей конструкции, кодирующей рекомбинантный белок. Для внехромосомных экспрессирующих систем следует изолировать экспрессирующую конструкцию и верифицировать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, не проводя дальнейшее клонирование. Для клеток с хромосомными копиями экспрессирующей конструкции нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, следует подтверждать с помощью повторного клонирования и секвенирования хромосомных копий. В качестве альтернативного варианта нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, можно верифицировать секвенированием пула клонов кДНК или материала, амплифицированного с помощью полимеразной цепной реакции. Кодирующая последовательность должна быть идентична (в границах предела обнаружения используемой методики) последовательности, требуемой для экспрессирующей конструкции, описанной в подразделе 3.1 настоящей главы, кроме того, она должна соответствовать ожидаемой аминокислотной последовательности белка.