6.1.1. Характеристика и подтверждение структуры

Аминокислотная последовательность. Необходимо, насколько это возможно, установить аминокислотную последовательность целевого продукта, используя подходы, подобно описанным в абзацах втором - пятом настоящего подраздела, и затем сравнить их с аминокислотной последовательностью, которая соответствует нуклеотидной последовательности гена целевого продукта.

Аминокислотный состав. Общий аминокислотный состав определяют, используя различные гидролитические и аналитические методики, и сравнивают с аминокислотной последовательностью, которая соответствует нуклеотидной последовательности гена целевого продукта. Во многих случаях анализ аминокислотного состава позволяет получить определенные ценные сведения о структуре пептидов и небольших белков, однако для больших белков эти данные менее точны. Во многих случаях результаты количественного аминокислотного анализа позволяют установить содержание белка.

Терминальные последовательности аминокислот. Анализ концевых аминокислот проводят для установления природы и однородности амино- и карбси-концевых аминокислот. Если целевой продукт является гетерогенным по концевым аминокислотам, с помощью соответствующей аналитической методики необходимо определить относительное содержание вариантных форм. Последовательность таких концевых аминокислот необходимо сравнить с последовательностью концевых аминокислот, соответствующей нуклеотидной последовательности гена целевого продукта.

Пептидная карта. Избирательная фрагментация препарата на отдельные пептиды осуществляется при помощи подходящих ферментов или химических соединений, а образующиеся пептидные фрагменты подвергаются анализу с помощью ВЭЖХ или иной подходящей аналитической методики. Используя такие методы, как анализ аминокислотного состава, N-концевое секвенирование или масс-спектрометрию, необходимо, насколько это возможно, идентифицировать пептидные фрагменты. Пептидное картирование активной фармацевтической субстанции или лекарственного препарата с помощью должным образом валидированной методики - это метод, часто использующийся для подтверждения структуры целевого продукта в целях выпускающего контроля качества серий.

Сульфгидрильные группы и дисульфидные мостики. Если согласно данным нуклеотидной последовательности гена целевого продукта предполагается наличие остатков цистеина, необходимо по возможности определить количество и положения всех свободных сульфгидрильных групп и (или) дисульфидных мостиков. С этой целью используют пептидное картирование (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях), масс-спектрометрию или иные подходящие технологии.

Углеводная структура. Необходимо определить содержание углеводов в гликопротеинах (нейтральные сахара, аминосахара и сиаловые кислоты). Кроме того, необходимо по возможности проанализировать структуру углеводных цепей, олигосахаридный профиль (профиль ветвления) и участки гликозилирования полипептидной цепи.