IV. Методы генетической диагностики стрессчувствительности и врожденного иммунного ответа у свиней

22. Суть методов генетической диагностики стрессчувствительности и врожденного иммунного ответа у свиней заключается в выделении фрагмента генов RYR1 и TLR 2 из целого генома животного с помощью специфических праймеров, ограничивающих данный фрагмент.

23. Методы диагностики RYR1 и TLR 2 свиней включают в себя следующие этапы:

взятие проб биологического материала;

выделение ДНК;

проведение амплификации (метод ПЦР) фрагмента гена RYR1, TLR 2 и оценка качества амплификата;

анализ полученных результатов.

24. RYR1 ген может содержать в своей структуре точечную мутацию в позиции 1843, являющуюся причиной чрезмерно острой реакции свиней на стресс - злокачественного гипертермического синдрома и низкого качества мяса (бледное, водянистое, мягкое). Наличие мутации в выделенном фрагменте выявляется с помощью специфического фермента, маркирующего измененный мутацией фрагмент RYR1-гена.

RYR F: 5' - GTGCTGGATGTCCTGTGTTCCCT-3', T = 60 °C

RYR R: 5' - CTGGTGACATAGTTGATGAGGTTTG-3', T = 60 °C

25. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются важными компонентами врожденного иммунного ответа и имеют решающее значение для иммунной системы. У свиней было идентифицировано десять различных семейств Toll-подобных рецепторов, как мембранных, так и внутриклеточных. Они способны распознавать бактериальные продукты вне клеток и вирусную нуклеиновую кислоту внутри клетки. Таким образом, некоторые TLR локализуются во внутриклеточных компартментах для распознавания вирусной или бактериальной нуклеиновой кислоты. Другие TLR находятся на поверхности клетки и распознают бактериальные продукты (липопротеины, пептидогликаны, липополисахариды). TLR 2 распознают продукты, содержащие бактерии и грибы (ЛПС (лептоспиры)), липоарабиноманнан (микобактерии), липопептиды, зимозан (грибы), (микоплазмы) (грамм+).

TLR 2 F: 5' - GCTGGACTTCTCCCACTTCC-3', T = 60 °C

TLR 2 R: 5' - AAGACCAGCATCGGACCAAG-3', T = 60 °C

26. Для проведения ПЦР в объеме 25 мкл используется 50 - 100 нг геномной ДНК. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл реакционной смеси помещаются в термоциклер для проведения 30 циклов амплификации.

Режим амплификации: проводится амплификация: денатурация - 94 °C (1 мин); отжиг - 60 °C (1 мин); элонгация - 72 °C (1 мин); достройка матрично-праймерных комплексов проходит при 72 °C (5 мин).

27. Концентрация и специфичность амплификата (фрагмент RYR1-гена, длиной 134 п.н., TLR 2 длиной 249 п.н.) оценивается электрофоретическим методом в 2% агарозном геле, напряжение 40 В в течение часа.

Амплифицированный фрагмент RYR1-гена представляет собой полосу, имеющую яркое, четко видимое свечение с длиной 134 п.н., TLR 2 длиной 249 п.н.).

28. Амплификаты из ядерной ДНК свиней должны представлять полосу длиной 134 п.н. (длина фрагмента определяется относительно маркера - ДНК-плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой Alu I).

29. При рестрикции полученных амплификатов эндонуклеазой Hin6I на электрофорезе должна наблюдаться следующая картина:

30. Гомозиготные животные имеют генотип NN (нормальный аллель обозначают как N). Они устойчивы к стресс-факторам и не являются носителями мутации.

31. Исчезновение сайта рестрикции свидетельствует о том, что в результате толковой мутации в позиции +1843 произошла замена основания C-цитозина на основание T-тимин в гене, ответственном за проявление повышенной чувствительности к стрессам. Мутантный аллель обозначается как n.

У гетерозиготной особи в геноме присутствуют два аллеля гена RYR1, один - поврежденный мутацией (n), другой - не поврежденный (N). Это генотип Nn. Фенотипически такие животные являются устойчивыми к стрессам, но несут в своем генотипе рецессивный мутантный аллель.

Животные с двумя мутантными аллелями (генотип nn) являются носителями мутации и обладают повышенной чувствительностью к стресс-факторам.