III. Планирование токсикологического эксперимента

3.1. Начальным этапом перед проведением токсикологического эксперимента является поиск литературных данных о кардиотоксическом действии исследуемых НЧ. Для анализа литературных данных используются экспериментальные исследования (in vitro, in vivo), а при наличии - и эпидемиологические.

3.2. Для оценки кардиотоксического действия НЧ на организм используются различные пути их поступления (например, ингаляционный, внутрибрюшинный, внутрижелудочный, интратрахеальный, интраназальный, внутримышечный, внутривенный).

3.3. В рамках каждой экспериментальной модели сравниваемые группы лабораторных крыс формируются рандомизированной выборкой из общего стада и содержатся в одинаковых контролируемых условиях, а исследования на них проводятся параллельно. Выбираются сопоставимые по виду, полу, возрасту и количеству крысы в группах. В сравниваемые группы входят сопоставимые по виду, полу, возрасту и количеству крысы. Рекомендуемая минимальная численность крыс в каждой группе - 6 особей, желательная - 10 - 12 особей. Отклонение по исходной массе тела крыс в группе не превышает 20% от средней массы в группе.

3.4. Для оценки сдвигов показателей состояния ССС, вызванных интоксикацией НЧ, используется сравнение с величинами, измеренными в группе контрольных крыс. Группе контрольных крыс вводится деионизированная вода или среда, которая используется для приготовления наносуспензий, тем же объемом, какой вводится опытным крысам в соответствии с методическими документами <1>.

--------------------------------

<1> Методические рекомендации "Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий", утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 06.12.1985 N 4050-85; ГОСТ 32647 "Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности", введенный приказом Госстандарта от 06.10.2014 N 1274-ст.

3.5. Для оценки влияния НЧ на ССС рекомендуется использовать моделирование интоксикации умеренной степени выраженности, которая проводится и оценивается в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 05.06.2009 (далее - МУ 1.2.2520-09); МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.05.2010 (далее - МУ 1.2.2635-10).

При подборе доз или концентраций для проведения исследований по оценке кардиотоксичности НЧ рекомендуется использовать данные:

- общетоксическое действие изучаемых НЧ, имеющиеся в научной литературе (при наличии использовать данные о характере зависимости "доза-эффект");

- установленные LD₅₀ или LC₅₀;

- механизмы кардиотоксического действия токсикантов, входящих в состав изучаемых НЧ, но в ионной форме, а также частиц химических аналогов микроразмерного диапазона;

- результаты предварительного пилотного эксперимента при однократном изолированном введении НЧ. По результатам такого пилотного эксперимента выбирается та доза или концентрация, при которой обнаруживаются изменение состояния организма (при оценке сдвигов базовых функциональных показателей), но при этом не развивается клиническая картина тяжелой интоксикации <3>.

--------------------------------

<3> МУ 1.2.2520-09; МУ 1.2.2635-10.

3.6. Комплексную оценку изменений ССС после экспозиционного периода рекомендуется осуществлять на разных уровнях организации живого организма (от молекулярного до системно-органного), но не менее чем по двум категориям:

- для оценки изменений у крыс ССС на системно-органном уровне неинвазивно регистрируются ЭКГ, по которой анализируется частота сердечных сокращений (далее - ЧСС), амплитуды зубцов P, R, T, продолжительность интервалов RR, PQ, QT, QRS, и параметры АД, где отмечается систолическое (далее - САД), диастолическое, среднее, пульсовое АД, минутный объем крови в соответствии с методическими документами <4>. Для минимальной оценки учитываются ЧСС и САД;

--------------------------------

<4> Методические указания "Ускоренная оценка действия химических соединений на сердечно-сосудистую систему в эксперименте с целью гигиенического нормирования", утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 31.12.1987 N 4546-87 (далее - МУ N 4546-87).

- на тканево-клеточном уровне выполняется гистологическая оценка тканей сердца и сосудов с морфометрией (размеры кардиомиоцитов, количество ядер на единицу площади препарата, ядерно-цитоплазматические отношения в миокарде, толщина функциональных слоев стенок сосудов);

- на молекулярном уровне рекомендуется оценивать соотношения тяжелых цепей миозина методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) либо экспрессию генов семейства CYP1 методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) в реальном времени;

- рекомендуется выполнять биохимический анализ сыворотки крови по показателям, характеризующим состояние ССС, например: активность лактатдегидрогеназы (далее - ЛДГ) и ее изоферментов в соответствии с методическими документами <5>, уровень кальция, С-реактивный белок (далее - СРБ), креатинкиназа (далее - КК), креатин-киназа-МВ (далее - КК-МВ), тропонин I, ангиотензинпревращающий фермент (далее - АПФ), миоглобин, натрийуретические пептиды, фактор роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor, далее - VEGF), эндотелии-1. Для минимальной оценки рекомендуется выполнять исследование не менее чем по 5 показателям.

--------------------------------

<5> МУ N 4546-87.

3.7. Перечень необходимого оборудования для проведения исследований представлен в приложении 1 к настоящим МР.