5.3. Изучение нарушений на молекулярном уровне

Для оценки соотношения тяжелых цепей миозин экстрагируется из сердечной ткани разных отделов сердца (предсердия, правый и левый желудочки) крыс всех исследуемых групп. Сердечная ткань каждого отдела в течение 10 минут измельчается в специальном растворе (следующего состава: 2% тритона X-100, 0,5 мМ фенилметилсульфонил флуорида, 5 мМ дитиотреитола (далее - ДТТ), 4 мМ MgCl₂, 1 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты и 20 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)) в соотношении 1 : 10 (масса ткани/объем раствора) и выдерживается в холодильнике при температуре плюс 4 °C в течение 10 - 15 минут. Данную смесь центрифугируют при 14500 g в течение 15 минут, и полученный осадок в течение 30 минут экстрагируют в буфере (следующего состава: 1 мМ аденозинтрифосфат, 4 мМ MgCl₂, 1 М KCl, 40 мМ фосфатного буфера (pH 6,5)) в соотношении 1 : 3. Затем смесь с данным буфером центрифугируют в течение 15 минут при 14500 g, а полученный после центрифуги супернатант смешивают с деионизированной водой в соотношении 1 : 10. Этот раствор выдерживается при температуре плюс 4 °C в течение 20 минут. После чего центрифугируется в течение 15 минут при 14500 g, и полученный осадок миозина растворяется в высокоионном буфере (следующего состава: 40 мМ фосфатного буфера, 1 М KCl, 4 мМ MgCl₂ (pH 6.5)) в соотношении 1 : 2. Миозин хранится не более суток до начала эксперимента. Все операции по выделению миозина и его хранение проводятся при температуре плюс 4 °C.

Состав изоформ тяжелых цепей миозина из миокарда разных отделов (предсердий, правого и левого желудочков) сердца крыс определяется с помощью вертикального денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза с додецил сульфатом натрия по методу Reiser & Kline [20, 22] с незначительными модификациями.

Рекомендуется использовать мини-гели размерами 100 x 120 x 0,75 мм. Концентрация полиакриламида составляет 8% для разделяющего (нижнего) геля и 4% - для концентрирующего (верхнего) геля при соотношении акриламида к бисакриламиду - 50 : 1.

Раствор разделяющего геля (следующего состава: 8% полиакриламида 50 : 1, 0,375 М буфера трис(гидроксиметил)аминометан-гидрохлорида (англ. Tri (Hydroxymethyl) Amino Methane Hydrochloride, далее - Tris-HCl) pH 8,8, 10% глицерола, 0,1% додецил сульфата натрия (англ, sodium dodecyl sulfate, далее - SDS), 0,1% персульфата аммония (англ. Ammonium persulfate, далее - APS), и 0,07% тетраметилэтилендиамина (англ. Tetramethylethylenediamine, далее - TEMED), деионизированная H₂O (до объема 10 мл)) заливается в установку из чистых стекол, сверху добавляется 120 мкл изопропанола для выравнивания и во избежание испарения геля. Полимеризация происходит в течение 30 - 40 минут.

Раствор концентрирующего геля (следующего состава: 4% полиакриламида 50 : 1, 0,14 М буфера Tris-HCl pH 6,8, 10% глицерола, 0,25% SDS, 6 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1% APS, 0,01% TEMED, деионизированная H₂O (до объема 4 мл)) заливается в установку поверх предыдущего геля с предварительной промывкой от изопропанола, сверху вставляются специализированные "гребенки" для создания "кармашков". Полимеризация концентрирующего геля происходит в течение 20 - 30 минут.

Пробы миозина растворяются в буфере для образцов следующего состава: 625 мМ Tris-HCl pH 6,8, 15 мМ ДТТ, 1% SDS, 0,01% бромфенолового голубого красителя, 15% глицерола. Концентрация миозина в буфере составляет 0,1 мг/мл. В каждый кармашек загружается по 3 - 7 мкл полученного раствора. Перед погружением в кармашки раствор белка нагревается в течение 3 минут при температуре плюс 85 °C.

Для проведения электрофоретического разделения используется специальный буфер для электрофореза (следующего состава: 50 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, 75 мМ глицина, 0,05% SDS и 0,07% -меркаптоэтанола) против того же буфера, разведенного в два раза. Электрофорез проводится при постоянном напряжении 100 мВ в течение 40 минут и далее при 160 мВ в течение 6 часов при температуре плюс 8 °C. Также используется альтернативный вариант при постоянной силе тока 15 мА в течение 40 минут, и затем 25 мА в течение 3 часов при температуре плюс 8 °C.

По окончании электрофореза гель промывается водой трижды по 5 минут. Окрашивание проводится с помощью краски Кумасси. Далее гель отмывается в растворе, содержащем 20% этилового спирта и 10% уксусной кислоты. Затем гель сканируется с помощью денситометра и определяется процентное соотношение и -тяжелых цепей миозина в пробе.

Экспрессия генов определяется в соответствии с методикой, описанной Ansari с соавторами [6].