Приложение

к Решению Коллегии

Евразийской экономической комиссии

от 25 июня 2024 г. N 75

ИЗМЕНЕНИЯ,

ВНОСИМЫЕ В РЕШЕНИЕ КОЛЛЕГИИ ЕВРАЗИЙСКОЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ

КОМИССИИ ОТ 11 АВГУСТА 2020 Г. N 100

1. Пункт 2 изложить в следующей редакции:

"2. Установить, что:

регистрационные досье лекарственных средств для медицинского применения должны быть приведены в соответствие с требованиями Фармакопеи Евразийского экономического союза, утвержденной настоящим Решением, до 1 января 2026 г.;

регистрационные досье ветеринарных лекарственных препаратов, зарегистрированных в соответствии с подпунктом "а" пункта 2 Решения Совета Евразийской экономической комиссии от 21 января 2022 г. N 1 "О Правилах регулирования обращения ветеринарных лекарственных средств на таможенной территории Евразийского экономического союза" (далее - Решение Совета Комиссии N 1), и регистрационные досье ветеринарных лекарственных препаратов с регистрационными удостоверениями, предусмотренными подпунктом "в" пункта 2 Решения Совета Комиссии N 1, должны быть приведены в соответствие с требованиями Фармакопеи Евразийского экономического союза не позднее 31 декабря 2027 г.;

регистрационные досье ветеринарных лекарственных препаратов, зарегистрированных в соответствии с подпунктом "б" пункта 2 Решения Совета Комиссии N 1, должны быть приведены в соответствие с требованиями Фармакопеи Евразийского экономического союза до даты истечения срока действия их регистрационных удостоверений согласно подпункту "г" пункта 2 Решения Совета Комиссии N 1.".

2. В Фармакопее Евразийского экономического союза, утвержденной указанным Решением:

а) наименование раздела 2.1.7 изложить в следующей редакции: "2.1.7. Отбор проб";

б) в общей фармакопейной статье 2.2.1.1:

код "202010001-2022" заменить кодом "202010001-2023";

в позиции, касающейся ацетонитрила P1, слова "Оптическая плотность (2.1.2.24). Не более 0,01" заменить словами "Оптическая плотность (2.1.2.24). Не более 0,10";

в) в наименовании раздела 2.3.9.0 слова "2.3.9.0. Применение" заменить словами "2.3.9. Применение";

г) дополнить общими фармакопейными статьями следующего содержания:

2. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ

2.1. МЕТОДЫ АНАЛИЗА

2.1.4. ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ

201040037-2023

2.1.4.37. МЕТАНОЛ И 2-ПРОПАНОЛ

Требования общей фармакопейной статьи распространяются на лекарственные средства - фармацевтические субстанции (настойки, настойки гомеопатические матричные, экстракты жидкие) и лекарственные препараты в жидких лекарственных формах (настойки, экстракты, растворы спиртовые и др.), содержащие в своем составе этанол.

Предельно допустимое содержание метанола в лекарственных средствах должно составлять не более 0,05% и 2-пропанола - не более 0,05%, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Испытания на содержание метанола и 2-пропанола могут быть проведены методами парофазной газовой хроматографии (метод 1) и газовой хроматографии (метод 2).

МЕТОД 1. ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола P1 доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Испытуемый раствор. К 1,0 мл раствора внутреннего стандарта прибавляют 4,0 мл испытуемого образца, доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают, при необходимости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Раствор сравнения (а). К 1,0 мл метанола P2 прибавляют 1,0 мл 2-пропанола P2, доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (б). 5,0 мл этанола безводного P доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают. 25,0 мл полученного раствора доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора внутреннего стандарта, 2,0 мл раствора сравнения (а) и 2,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Условия хроматографирования:

- колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покрытая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диметил]силоксана P толщиной 3 мкм;

- газ-носитель: гелий для хроматографии P;

- скорость газа-носителя: 3 мл/мин;

- деление потока: 1:50;

- условия парофазной хроматографии:

- режим изменения температуры:

- детектор: пламенно-ионизационный;

- объем вводимой пробы: по 1 мл газовой фазы испытуемого раствора и раствора сравнения (в).

Порядок элюирования веществ (раствор сравнения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол.

Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол - около 0,8; 2-пропанол - около 1,2; пропанол - около 1,6.

Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)):

- разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола.

Содержание метанола в объемных процентах (об/об) рассчитывают по формуле:

где: S₁ - площадь пика метанола на хроматограмме испытуемого раствора;

S₂ - площадь пика метанола на хроматограмме раствора сравнения (в);

S'₁ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

S'₂ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).

Содержание 2-пропанола в объемных процентах (об/об) рассчитывают по формуле:

где: S₃ - площадь пика 2-пропанола на хроматограмме испытуемого раствора;

S₄ - площадь пика 2-пропанола на хроматограмме раствора сравнения (в);

S'₁ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

S'₂ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).

МЕТОД 2. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Раствор внутреннего стандарта. 1,0 мл пропанола P доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают.

Испытуемый раствор. 4,0 мл испытуемого образца и 1,0 мл раствора внутреннего стандарта доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают, при необходимости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Раствор сравнения (а). 1,0 мл метанола P и 1,0 мл 2-пропанола P доводят водой P до объема 100,0 мл и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (б). 1,0 мл этанола безводного P доводят водой P до объема 50,0 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (в). 1,0 мл раствора внутреннего стандарта, 2,0 мл раствора сравнения (а) и 1,0 мл раствора сравнения (б) доводят водой P до объема 20,0 мл и перемешивают.

Условия хроматографирования:

- колонка: из расплавленного кварца длиной 30,0 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покрытая слоем поли[(цианопропил)(фенил)][диметил]силоксана P толщиной 3 мкм;

- газ-носитель: гелий для хроматографии P;

- скорость газа-носителя: 3 мл/мин;

- деление потока: 1:50;

- режим изменения температуры:

- детектор: пламенно-ионизационный;

- объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения (в).

Порядок элюирования веществ (раствор сравнения (в)): метанол, этанол, 2-пропанол, пропанол.

Относительное удерживание (время удерживания этанола около 5,3 мин): метанол - около 0,8; 2-пропанол - около 1,2; пропанол - около 1,6.

Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (в)):

- разрешение: не менее 5 между пиками метанола и этанола.

Содержание метанола в объемных процентах (об/об) рассчитывают по формуле:

где: S₁ - площадь пика метанола на хроматограмме испытуемого раствора;

S₂ - площадь пика метанола на хроматограмме раствора сравнения (в);

S'₁ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

S'₂ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).

Содержание 2-пропанола в объемных процентах (об/об) рассчитывают по формуле:

где: S₃ - площадь пика 2-пропанола на хроматограмме испытуемого раствора;

S₄ - площадь пика 2-пропанола на хроматограмме раствора сравнения (в);

S'₁ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

S'₂ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в).

2.1.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

201060011-2023

2.1.6.11. ИСПЫТАНИЕ ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ

Общая фармакопейная статья описывает метод испытания на нейровирулентность живых вирусных вакцин.

В каждом испытании используют не менее десяти обезьян (нечеловекообразных приматов), клинически здоровых и серонегативных по отношению к испытуемому вирусу. Каждой из обезьян в таламический отдел каждого полушария головного мозга вводят не менее 0,5 мл испытуемого образца при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Доза вакцины, введенной обезьяне, не должна быть меньше, чем разовая доза вакцины, рекомендованная для человека.

Для обнаружения возможной контаминации дикими нейровирулентными вирусами контрольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян, содержат совместно с группой иммунизированных обезьян или в непосредственной близости от них. Иммунизированных обезьян наблюдают 17 - 30 сут при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, а обезьян из контрольной группы - в течение того же периода и дополнительно 10 сут. Во время наблюдения в группах отмечают возникновение неврологических и других клинически важных симптомов. Гибель животных в первые 48 ч после инъекции считают неспецифического характера, а сами животные могут быть заменены другими.

Результаты испытания являются достоверными, если:

- не более 20% иммунизированных обезьян погибают по неспецифическим причинам;

- образцы сыворотки крови обезьян контрольной группы, отобранные во время иммунизации испытуемых животных и через 10 сут после эвтаназии последних, не имеют признаков инфекции, вызванной диким вирусом испытуемого типа или вирусом кори.

По окончании периода наблюдения выполняют аутопсию и гистологическое изучение соответствующих отделов мозга для выявления признаков поражения центральной нервной системы. Испытуемый образец выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидаемых клинических и гистологических признаков поражения центральной нервной системы, которые могут быть вызваны введенным вирусом.

201060012-2023

2.1.6.12. ИСПЫТАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА C

Испытание на бактериальные эндотоксины с использованием рекомбинантного фактора C (recombinant factor C, rFC) применяют для количественного определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий. Испытания с использованием rFC, основанные на последовательности гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda), выполняют с использованием метода флуориметрии.

Испытание осуществляют таким образом, чтобы избежать контаминации бактериальными эндотоксинами.

Рекомендации по применению испытания на бактериальные эндотоксины представлены в общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Применение испытания на бактериальные эндотоксины.

ОБОРУДОВАНИЕ

Стеклянную посуду и другое термостойкое оборудование депирогенизируют методом сухожаровой стерилизации, используя валидированный процесс. Как правило, минимальное время и температура стерилизации составляют 30 мин при 250 °C. Если используют оборудование из полимерных материалов (например, микротитровальные планшеты и наконечники для автоматических пипеток), необходимо подтвердить отсутствие на них поддающихся обнаружению эндотоксинов и других мешающих факторов.

РЕАКТИВЫ

Реактивы

Рекомбинантный фактор C кодируется последовательностью гена мечехвоста (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas или Carcinoscorpius rotundicauda). Все реактивы, включая флуорогенный субстрат и буферный раствор для анализа, не должны содержать эндотоксины выше предела обнаружения.

Растворы реактивов

При необходимости реактивы готовят в соответствии с инструкцией производителя набора для испытания. Реактивы хранят охлажденными или замороженными в соответствии с инструкцией производителя.

Вода для испытания на бактериальные эндотоксины

Вода для инъекций P или иная подходящая вода, не реагирующая с реактивом rFC на его пределе чувствительности.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСХОДНОГО РАСТВОРА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА

Исходный раствор стандартного образца эндотоксина готовят из стандартного образца эндотоксина, например, СО ФЕАЭС эндотоксина, калиброванного относительно международного стандартного образца.

Содержание бактериальных эндотоксинов в международном стандартном образце устанавливается Всемирной организацией здравоохранения и выражается в международных единицах (МЕ). 1 МЕ эндотоксина эквивалентна 1 ЕЭ (единица эндотоксина).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА

Исходный раствор стандартного образца эндотоксина энергично перемешивают и готовят подходящую серию разведений, используя воду для испытания на бактериальные эндотоксины.

Во избежание потери активности вследствие адсорбции растворы используют по возможности быстрее.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМЫХ РАСТВОРОВ

Испытуемые растворы готовят путем растворения или разведения испытуемого образца субстанции для фармацевтического применения или лекарственного препарата с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины. Для некоторых из них может быть более подходящим растворение или разведение в других водных растворах. При необходимости доводят pH испытуемого раствора так, чтобы после смешивания реактивов и испытуемого раствора значение pH полученной смеси находилось в диапазоне, указанном производителем набора реактивов (обычно от 6,0 до 8,0). Значение pH доводят кислотой, основанием или подходящим буферным раствором в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов. Кислота или основание могут быть приготовлены из концентратов или твердых веществ с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины в контейнерах, не контаминированных эндотоксинами. Буферные растворы не должны содержать эндотоксины выше предела обнаружения и другие мешающие факторы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОГО РАЗВЕДЕНИЯ

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, позволяющее определить предельное содержание эндотоксина. МДР рассчитывают по формуле:

где: ПСЭ - предельное содержание эндотоксинов;

C - концентрация испытуемого раствора;

- чувствительность лизата амебоцитов в международных единицах в миллилитре.

Предельное содержание эндотоксинов для действующего вещества рассчитывают на основе дозы лекарственного препарата для парентерального применения по формуле:

где: K - предельная пирогенная доза эндотоксина на килограмм массы тела;

M - максимальная разовая доза лекарственного препарата на килограмм массы тела.

Если лекарственный препарат вводится с частыми интервалами или инфузионно, величина M соответствует общей максимальной дозе, вводимой в течение 1 ч.

Предельное содержание эндотоксинов выражают в единицах: МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/ЕД и др.

Концентрацию испытуемого раствора выражают в единицах:

- мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в массовых единицах (МЕ/мг);

- ЕД/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/ЕД);

- мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов указано в объемных единицах (МЕ/мл).

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ФЛУОРИМЕТРИИ

Метод используют для измерения флуоресценции (относительные единицы флуоресценции, ОЕФ), излучаемой флуоресцентным субстратом (реактивом) после его расщепления rFC, активируемым эндотоксином.

Используют метод определения флуоресценции в конечной точке, основанный на количественной зависимости концентрации эндотоксина от флуоресценции смеси реактивов в конце инкубационного периода, выражаемой, например, как :

где: ОЕФt_i - флуоресценция смеси реактивов в конце инкубационного периода;

ОЕФt₀ - флуоресценция смеси реактивов в начале инкубационного периода.

Испытание выполняют при температуре инкубации в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов (обычно (37 1) °C).

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

В ходе предварительных испытаний подтверждают правильность выполнения метода. При этом должны выдерживаться требования, предъявляемые к калибровочной кривой (см. раздел Критерии приемлемости калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина данной общей фармакопейной статьи), а испытуемый раствор не должен оказывать влияния на проведение испытания (см. раздел Мешающие факторы данной общей фармакопейной статьи).

При внесении в условия испытания изменений, способных повлиять на его результаты, необходимо провести валидацию методики испытания.

КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА

Испытание должно быть выполнено для каждой серии реактива rFC.

Чувствительность прибора должна быть настроена в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов для испытания.

Для построения калибровочной кривой используют исходный раствор стандартного образца эндотоксина, из которого готовят не менее трех растворов с концентрациями эндотоксина в диапазоне, указанном производителем набора реактивов. Если требуемый для испытания диапазон превышает 2 lg диапазона, указанного производителем, необходимо использовать дополнительные растворы эндотоксина с шагом lg. Выполняют испытание, используя не менее трех повторностей растворов каждой концентрации эндотоксина в соответствии с инструкцией производителя (соотношение объемов, время инкубации, температура, pH и др.).

Абсолютное значение коэффициента корреляции |r| для диапазона приготовленных концентраций эндотоксина должно быть не менее 0,980.

МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Поскольку при проведении испытания с реактивом rFC фактор G не используется, то получения ложноположительных результатов вследствие его активации не ожидается, что требует учета при сравнении метода с другими методами количественной оценки бактериальных эндотоксинов.

Концентрацию эндотоксинов выбирают около центра калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина.

Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с таблицей 2.1.6.12.-1. Выполняют испытание не менее чем на двух повторностях этих растворов в соответствии с инструкцией производителя набора реактивов для испытания (объемы испытуемого раствора и смеси реактивов, объемное соотношение испытуемого раствора и смеси реактивов, время инкубации и др.).

Результаты испытания считают достоверными, если выполняются следующие условия:

- абсолютное значение коэффициента корреляции калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина не менее 0,980;

- результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC.

Рассчитывают среднее значение открываемости добавленного эндотоксина, вычитая из среднего значения концентрации эндотоксина в растворе B (содержащего добавленный эндотоксин, таблица 2.1.6.12.-1) среднее значение концентрации эндотоксина в растворе A (если эндотоксин обнаружен, таблица 2.1.6.12.-1).

Таблица 2.1.6.12.-1. - Приготовление растворов для испытания

Примечание.

Раствор A - испытуемый раствор, разведение которого не превышает МДР.

Раствор B (положительный контроль) - испытуемый раствор в таком же разведении, как и раствор A, содержащий добавленный эндотоксин в концентрации, близкой к центру калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина.

Раствор C - раствор стандартного образца эндотоксина в концентрациях, используемых при валидации методики, как описано в разделе Критерии приемлемости калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина данной общей фармакопейной статьи.

Раствор D (отрицательный контроль) - вода для испытания на бактериальные эндотоксины.

Считают, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания измеренная концентрация эндотоксина, добавленного в испытуемый раствор, находится в пределах 50 - 200% от известной концентрации добавленного эндотоксина после вычитания любого эндотоксина, обнаруженного в растворе без добавления эндотоксина.

Если значение открываемости эндотоксина выходит за пределы указанного диапазона, считают, что испытуемый раствор содержит мешающие факторы. Повторяют испытание, используя большее разведение, не превышающее МДР. Кроме того, влияние испытуемого раствора (в разведении, не превышающем МДР) можно устранить обработкой с помощью валидированных методов, таких как фильтрация, нейтрализация, диализ, термическая обработка или этапы связывания, специфичные для эндотоксина (обогащение эндотоксина из испытуемого раствора до обнаружения при отсутствии мешающей матрицы). Для установления эффективности устранения мешающего влияния выбранным методом обработки без потери эндотоксинов повторяют испытание на мешающие факторы, добавляя к испытуемому раствору стандартный раствор эндотоксина, с последующей его обработкой выбранным методом.

ИСПЫТАНИЕ

МЕТОДИКА

Проводят испытание по методике, описанной в разделе Мешающие факторы данной общей фармакопейной статьи.

РАСЧЕТЫ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Рассчитывают концентрацию эндотоксинов для каждой повторности раствора A, используя калибровочную кривую стандартного образца эндотоксина, полученную на основании раствора C стандартного образца эндотоксина.

Результаты испытания считаются достоверными, если выполняются следующие условия:

- результаты, полученные для раствора C, соответствуют требованиям к валидации, указанным в разделе Критерии приемлемости калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина данной общей фармакопейной статьи;

- открываемость эндотоксина, рассчитанная из концентрации эндотоксина, обнаруженной в растворе B, после вычитания концентрации эндотоксина, обнаруженного в растворе A, находится в диапазоне 50 - 200%;

- результат, полученный с раствором D, не превышает предельного значения, указанного в инструкции производителя набора реактивов, или меньше предела обнаружения эндотоксина для используемого реактива rFC.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Испытуемый образец выдерживает испытание, если средняя концентрация эндотоксинов в повторностях раствора A с учетом разведений и концентраций ниже предельного содержания эндотоксинов.

201060013-2023

2.1.6.13. ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ

Настоящая фармакопейная статья представляет методы для обнаружения или количественного определения бактериальных эндотоксинов и пирогенов неэндотоксиновой природы с использованием моноцитов или моноцитарных клеток человека в испытаниях in vitro.

Испытание на активацию моноцитов подходит для замены испытания Пирогенность после валидации методики для конкретного лекарственного средства.

Дополнительную информацию о практических аспектах испытаний можно найти в разделе Рекомендации по применению данной общей фармакопейной статьи.

1. ВВЕДЕНИЕ

В основу методов на активацию моноцитов положена способность моноцитов или моноцитарных клеток человека в присутствии пирогенных веществ продуцировать эндогенные медиаторы, в частности, провоспалительные цитокины (фактор некроза опухолей , и интерлейкин-6 (ИЛ-6) и др.). Провоспалительные цитокины принимают участие в патогенезе лихорадки, поэтому испытание на активацию моноцитов может выявлять весь спектр пирогенов в испытуемом образце.

При испытании лекарственных средств, содержащих неэндотоксиновые пирогены (например, пептидогликаны, дрожжи, грибы, вирусы) или провоспалительные цитокины, часто получают очень крутые или нелинейные кривые зависимости "доза - ответ", в сравнении с кривыми зависимости "доза - ответ" эндотоксинов. Лекарственные средства, которые могут содержать пирогены, отличные от бактериальных эндотоксинов, необходимо испытывать в диапазоне концентраций, включающих минимальное разведение.

В данной общей фармакопейной статье представлены три метода.

Метод 1. Количественное испытание.

Метод 2. Полуколичественное испытание.

Метод 3. Сравнительное испытание с контрольной серией (серия, утвержденная в качестве контрольной).

Испытания проводит таким образом, чтобы избежать контаминации пирогенами.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Максимально допустимое разведение представляет собой наибольшее разведение испытуемого образца, при котором может быть определено предельно допустимое содержание пирогена. Максимально допустимое разведение рассчитывают по формуле:

где: ПСП - предельное содержание пирогенов;

C - концентрация испытуемого раствора.

Поскольку предел обнаружения не всегда известен заранее, для расчета максимально допустимого разведения могут быть использованы архивные данные.

Критерием приемлемости для принятия положительного или отрицательного решения является предельное содержание пирогенов, которое выражают в эквиваленте единиц эндотоксина на миллиграмм или миллилитр, или на единицу биологической активности лекарственного средства.

Предельное содержание пирогенов рассчитывают по формуле:

где: K - предельная пирогенная доза бактериального эндотоксина из расчета на килограмм массы тела;

M - максимальная разовая доза испытуемого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела.

В случае введения лекарственного препарата через частые интервалы или инфузионно, в качестве "M" используют общую максимальную дозу, введенную в течение одного часа.

В случае, когда для лекарственного средства установлено предельное содержание эндотоксина, предельное содержание пирогенов будет равно предельному содержанию эндотоксинов, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. В этом случае концентрация испытуемого раствора выражается:

- в мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов установлено в массовых единицах (МЕ/мг);

- в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед);

- в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объемных единицах (МЕ/мл).

Эквиваленты эндотоксина - значения концентрации пирогенного вещества, вычисленные по кривой "доза - ответ" стандартного образца эндотоксина (метод 1) или значения, рассчитываемые путем сравнения реакций с растворами стандартного образца эндотоксина (метод 2). Исходный раствор готовят из стандартного образца эндотоксина, калиброванного относительно Международного стандарта эндотоксина, например СО ФЕАЭС эндотоксина.

Предел обнаружения определяют с использованием калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Предел обнаружения представляет собой концентрацию эндотоксина, равную предельному значению, выраженному в единицах, соответствующих показаниям детектирующих приборов (например, для иммуноферментного анализа используют поглощение (оптическую плотность). Для целей данного испытания предел обнаружения выражают как эквивалент эндотоксина на миллилитр.

Предельное значение рассчитывают по формуле:

где: - среднее значение четырех повторностей реакций на отрицательный контроль (R₀);

s - стандартное отклонение четырех повторностей реакций на отрицательный контроль (R₀).

3. ОБЩАЯ ПРОЦЕДУРА

Испытуемый раствор инкубируют с источником моноцитов человека или с линией моноцитарных клеток человека. Источником моноцитов человека могут быть: гепаринизированная периферическая кровь человека, отобранная не более чем за 4 ч до испытания; моноцитсодержащая фракция крови, например, мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные центрифугированием в градиенте плотности.

Гепаринизированную периферическую кровь человека обычно разводят культуральной средой или физиологическим раствором, например, до концентрации от 2% до 50% (об/об). Мононуклеарные клетки периферической крови человека или линии моноцитарных клеток в культуральной среде с добавлением плазмы донора или сыворотки AB (IV группа крови) обычно используют при окончательной плотности клеток 0,1 - 1,0 x 10⁶ клеток на лунку, пробирку или другую емкость. При использовании линий моноцитарных клеток сыворотку AB можно заменить на фетальную бычью сыворотку, инактивированную нагреванием.

Культура клеток готовится при температуре (37 1) °C в подходящей атмосфере для культуральной среды, например, увлажненном воздухе с 5% CO₂. Продолжительность культивирования должна быть достаточной для накопления маркеров пирогена. Реакцию выбранного маркера, например, провоспалительного цитокина, сравнивают с реакциями на стандартный образец эндотоксина или контрольную серию испытуемого препарата.

4. ОБОРУДОВАНИЕ

Всю стеклянную посуду и другой расходный материал, устойчивую к нагреванию, депирогенизируют в стерилизационном воздушном шкафу с использованием валидированной процедуры. Общепринятым минимальным режимом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °C не менее 30 минут. Если используют пластиковый материал, в частности микропланшеты и наконечники для автоматических пипеток, необходимо убедиться, что данное оборудование не содержит пирогенов и не влияет на испытание.

5. ИСТОЧНИКИ КЛЕТОК И КВАЛИФИКАЦИЯ

5.1. ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ

Цельную кровь получают от доноров или от пулов цельной крови, которые квалифицируют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи.

5.2. МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из крови, полученной от доноров или из пулов цельной крови, которые квалифицируют в соответствии с требованиями, описанными в разделах 5.3, 5.4, 5.5 и, где это применимо, в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи.

5.3. КВАЛИФИКАЦИЯ ДОНОРОВ

Доноры крови должны соответствовать приведенным квалификационным критериям наряду с другими действующими требованиями в отношении согласия на процедуру, здоровья, безопасности и этических принципов. Доноры должны описывать себя как "здоровые", "не страдающие любыми бактериальными или вирусными инфекциями" и "не имеющие симптомов любой инфекции в течение периода не менее одной недели перед сдачей крови". Доноры не должны принимать нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты в течение 48 ч перед сдачей крови и стероидные противовоспалительные лекарственные препараты - в течение 7 дней перед сдачей крови. Лица, которым были назначены иммунодепрессанты или другие лекарственные препараты, которые влияют на выработку выбранных показателей, не могут быть донорами крови. Донорская кровь должна быть обследована на инфекционные маркеры в соответствии с национальными требованиями по трансфузиологии.

5.4. КВАЛИФИКАЦИЯ КЛЕТОК, ОБЪЕДИНЕННЫХ ОТ РЯДА ДОНОРОВ

Пулы (цельной крови или компонентов крови, например мононуклеарные клетки периферической крови) должны состоять из порций крови минимум от четырех индивидуальных доноров, но предпочтительно от восьми или более доноров; пулы формируются путем отбора от каждого пакета донорской крови приблизительно одинаковых объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови. Для квалификации объединенных в пул клеток действуют следующим образом: в течение 4 ч с момента сбора крови строят кривые "доза - ответ" для пула с использованием растворов стандартного образца эндотоксина в не менее чем четырех разведениях, например, в диапазоне от 0,01 МЕ/мл до 4 МЕ/мл.

Кривые "доза - ответ" должны отвечать двум критериям для калибровочной кривой, описанным в разделе 6.1 данной общей фармакопейной статьи. Если пул должен использоваться для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, то пулы должны быть квалифицированы, как описано в разделе 6.3 данной общей фармакопейной статьи. При объединении клеток эффект усреднения должен учитываться при утверждении статуса соответствия ("соответствует" или "не соответствует") спецификации данного продукта.

5.5. КВАЛИФИКАЦИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК

В качестве источника клеток в испытании на активацию моноцитов могут быть использованы криоконсервированные клетки, например, кровь доноров, мононуклеарные клетки периферической крови или моноцитарные клеточные линии. Пулы криоконсервированных клеток получают объединением перед замораживанием или объединением единичных криоконсервированных донорских порций сразу же после оттаивания. Квалификацию криоконсервированной крови или клеток выполняют сразу же после оттаивания (и объединения, в случае необходимости). Кривые "доза - ответ" для криоконсервированных крови или клеток должны отвечать двум критериям для калибровочной кривой, описанным в разделе 6.1 данной общей фармакопейной статьи. Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их квалификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи.

5.6. НЕПРЕРЫВНАЯ ЛИНИЯ МОНОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК

Моноцитарные клеточные линии подходят для обнаружения бактериальных эндотоксинов, но имеют ограниченное применение для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов. Линию моноцитарных клеток необходимо постоянно культивировать для обеспечения достаточного количества клеток при использовании в испытании на активацию моноцитов. Для оптимизации метода можно использовать клоны, полученные из клеточной линии.

Клеточные линии должны поддерживаться в асептических условиях и регулярно контролироваться на контаминацию микоплазмами. Кроме того, клетки должны регулярно проверяться на идентичность (например, время удвоения, морфология и функции) и стабильность.

Функциональная стабильность клеточной линии оценивается путем наблюдения за ее состоянием с учетом количества пассажей в процессе рутинных испытаний. Должны быть установлены критерии функциональной стабильности, которые могут включать критерии роста, максимальную реакцию, полученную в испытании, фоновый шум и экспрессию рецептора. Экспрессию рецептора можно проверить с помощью специфических лигандов, например, липополисахарида для толл-подобного рецептора 4 (TLR₄), липотейхоевой кислоты для толл-подобного рецептора 2 (TLR₂), синтетического бактериального липопротеина для TLR₂-TLR₁ или синтетического бактериального липопротеина для TLR₂-TLR₆ или флагеллина.

Кривые зависимости "доза - ответ" должны соответствовать двум критериям калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина, описанным в разделе 6.1 данной фармакопейной статьи. Если клетки предназначены для обнаружения неэндотоксиновых пирогенов, их квалификация должна проводиться в соответствии с разделом 6.3 данной общей фармакопейной статьи.

6. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

Для обеспечения прецизионности и точности испытания на активацию моноцитов проводят предварительные испытания, в которых проверяют выполнение критериев для кривой стандартного образца эндотоксина, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать эндотоксины и неэндотоксиновые пирогены, отсутствие влияния растворов на детектирующую систему. Проведение испытаний на мешающие факторы требуется, если в условия эксперимента вносятся какие-либо изменения, которые могут повлиять на его результат.

6.1. КРИТЕРИИ ПРИЕМЛЕМОСТИ ДЛЯ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЭНДОТОКСИНА

Из раствора стандартного образца эндотоксина готовят не менее 4 растворов с различными концентрациями эндотоксина для построения калибровочной кривой. Проводят испытание, используя не менее 4 повторностей каждой концентрации раствора стандартного образца эндотоксина. Базовое высвобождение выбранного маркера в отсутствие добавленного раствора стандартного образца эндотоксина должно быть оптимизировано до наиболее низкого возможного уровня (например, при использовании иммуноферментного анализа оптическая плотность ниже 0,1).

Для калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина должны выполняться два критерия приемлемости:

- регрессионная зависимость ответов (соответственно преобразованных при необходимости) от lg дозы должна быть статистически значима (p < 0,01);

- регрессионная зависимость ответов на lg дозы не должна существенно отличаться от линейности (p > 0,05) (2.3.12.0).

6.2. ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Для обеспечения точности испытания проводят предварительные испытания, подтверждающие отсутствие влияния испытуемого образца на результаты испытания. Используя подходящий растворитель, готовят разведения испытуемого образца в геометрической прогрессии (1:2, 1:4 и т.д.), не превышающие максимально допустимого разведения. Аналогично готовят разведения испытуемого образца и прибавляют эндотоксин в соответствующей концентрации. В качестве альтернативы можно использовать разбавитель, содержащий добавленный эндотоксин в соответствующей концентрации. В обоих случаях соответствующая концентрация эндотоксина равна или близка к середине калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина (метод 1) или вдвое превышает расчетное значение предела обнаружения (метод 2).

Проводят испытания полученных рядов разведений параллельно в одном эксперименте. Для вычисления концентрации эквивалентов эндотоксина в каждом растворе используют калибровочную кривую.

Вычисляют среднее значение открываемости добавленного эндотоксина в растворе с добавлением стандартным образцом эндотоксина. Для этого из концентрации эквивалента эндотоксина в растворе с добавленным стандартным образцом эндотоксина вычитают среднюю концентрацию эквивалента эндотоксина в растворе (при его наличии).

Считают, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания вычисленная концентрация эквивалентов эндотоксина в испытуемом растворе с добавлением стандартного образца эндотоксина находится в пределах от 50% до 200% от известной концентрации добавленного стандартного образца эндотоксина, после вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина, обнаруженных в растворе без добавления стандартного образца эндотоксина. Если испытание не отвечает этому критерию, следует провести испытание методом 3.

В методе 3 разведения исследуемых и контрольных серий зависят от типа анализа, используемого для сравнения между ними. Тип анализа должен быть обоснован и валидирован для каждого лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Например, испытания проводят на 3 разведениях испытуемого образца: наибольшая концентрация (наименьшее разведение), при котором наблюдают наибольшее высвобождение выбранного маркера, и двукратные разведения непосредственно выше и ниже выбранного разведения. В связи с тем, что концентрация испытуемого образца с наибольшим высвобождением выбранного маркера может зависеть как от особенностей клеток или крови донора, так и серии лекарственного средства, должна быть проведена валидация методики в отношении конкретного лекарственного средства в трех независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров. Наибольшая концентрация (наименьшее разведение), при которой регистрируется наибольшее высвобождение выбранного маркера у большинства доноров и двукратные разведения непосредственно ниже и выше выбранного разведения, считаются пригодными для дальнейшего выполнения испытания.

Если наибольшее высвобождение выбранного маркера происходит при испытании исходного испытуемого раствора, то последующее испытание должны выполнять с использованием неразведенного (исходного) испытуемого раствора, а также испытуемого раствора, разведенного в соотношениях 1:2 и 1:4 перед его добавлением к моноцитарным клеткам. Степень разведения для этих трех растворов обозначают как f₁, f₂ и f₃.

Если содержание пирогена в образце исходно высокое, то целесообразнее использовать модель параллельных линий для анализа кривых "доза - ответ" для испытуемой и контрольной серий. В таком случае растворы испытуемых образцов испытывают в 3 или более геометрических разведениях, которые охватывают диапазон кривой "доза - ответ", используемый для выбранного анализа (2.3.12.0).

6.3. ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЭНДОТОКСИНОВЫХ ПИРОГЕНОВ

В предварительных испытаниях также подтверждают способность выбранной тест-системы обнаруживать не только бактериальные эндотоксины, но и неэндотоксиновые пирогены. Пригодность метода для конкретного лекарственного средства должна быть проверена. Для этого можно использовать архивные серии, наличие в которых неэндотоксиновых пирогенов было определено по положительным реакциям в испытании Пирогенность или при развитии лихорадочных реакций у человека. При отсутствии таких серий лекарственных средств предварительные испытания должны включать валидацию используемой методики с использованием не менее двух неэндотоксиновых лигандов толл-подобных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевой кислоты, синтетических бактериальных липопротеинов, флагеллина и неочищенного бактериального экстракта цельных клеток. Выбор неэндотоксинового пирогена должен отражать наиболее вероятное загрязнение исследуемого лекарственного средства.

6.4. ВЛИЯНИЕ НА СИСТЕМУ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ

Определяют оптимальное разведение раствора испытуемого образца и проверяют его влияние на систему детектирования (например, иммуноферментного анализа) для выбранного маркера. Различие в определяемых концентрациях разведений стандарта выбранного маркера в присутствии и отсутствии испытуемого образца должно находиться в диапазоне 20% поглощения (оптической плотности).

7. МЕТОДЫ

7.1. МЕТОД 1: КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ

Метод 1 основан на сравнении реакции испытуемого лекарственного средства с калибровочной кривой раствора стандартного образца эндотоксина. Концентрация пирогенных веществ в испытуемом лекарственном средстве не должна превышать значение предельного содержания пирогенов.

7.1.1. Процедура испытания

Используя валидированную методику испытания, готовят растворы, представленные в таблице 2.1.6.13.-1. Квалифицированные клетки культивируют в четырех повторностях с каждым из растворов.

Таблица 2.1.6.13.-1. - Приготовление растворов для испытания

Примечание.

f - разведение раствора.

Раствор A - раствор испытуемого лекарственного средства в наименьшем разведении f, при котором было проведено испытание на мешающие факторы, то есть наибольшая концентрация (наименьшее разведение), для которой открываемость эндотоксина находится в пределах от 50% до 200%.

Раствор B - двукратное разведение раствора A, не превышающее максимально допустимого разведения.

Раствор C - двукратное разведение раствора B, не превышающее максимально допустимого разведения.

Раствор AS - раствор A, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации, равной середине калибровочной кривой (R₃).

Раствор BS - раствор B, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации, равной середине калибровочной кривой (R₃).

Раствор CS - раствор C, содержащий стандартный образец эндотоксина в концентрации равной середине калибровочной кривой (R₃).

Раствор R₀ - отрицательный контроль.

Растворы R₁ - R₄ - растворы стандартного образца эндотоксина в концентрациях, использованных в испытании на мешающие факторы.

7.1.2. Вычисления и обработка результатов

Для обработки результатов используют данные, относящиеся к клеткам, соответствующие двум критериям калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина. Для каждого источника клеток (индивидуальное донорство, донорский пул или клеточная линия) при расчете концентрации эквивалентов эндотоксина в каждой из повторностей растворов A, B, C, AS, BS и CS используют калибровочную кривую R₁ - R₄.

Открываемость эквивалентов эндотоксина, рассчитанная путем вычитания концентрации эквивалентов эндотоксина в растворе A, B, C из концентраций эквивалентов эндотоксина в растворе AS, BS и CS, соответственно, должна находиться в диапазоне от 50% до 200%. Разведения, не соответствующие данным условиям, исключают из дальнейшей обработки.

Испытуемое лекарственное средство отвечает требованиям испытаний для конкретного источника клеток, если средние концентрации эквивалентов эндотоксина, полученные в повторностях раствора A, B и C, с учетом поправок на разведение, меньше предельного содержания пирогенов, установленного для испытуемого лекарственного средства. Одно отвечающее требованиям разведение является минимальным требованием для признания пригодности испытания.

7.1.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства

При использовании клеток от индивидуальных доноров испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание, проведенное с клетками от каждого из четырех различных доноров. Если испытуемое лекарственное средство выдерживает испытание с клетками от трех из четырех доноров, то испытание продолжают с клетками от других четырех доноров, клетки от которых не использовались в первом испытании. Испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с клетками от семи из восьми различных доноров (то есть допускается только одна положительная реакция при использовании клеток от восьми доноров). Если источник моноцитов представляет собой клетки, объединенные от ряда индивидуальных доноров, испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с одним пулом клеток.

При использовании линии моноцитарных клеток человека испытуемое лекарственное средство должно выдерживать испытание с одним соответствующим пассажем клеток.

7.2. МЕТОД 2: ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ

При испытании методом 2 проводят сравнение испытуемого лекарственного средства со стандартным образцом эндотоксина. Концентрация пирогена в испытуемом лекарственном средстве должна быть меньше предельного содержания пирогенов. Для принятия решения о соответствии испытания используют раствор A, при отсутствии другого обоснования и разрешения уполномоченного органа.

7.2.1. Процедура испытания

Используя валидированную методику испытания, готовят растворы, представленные в таблице 2.1.6.13.-2. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях.

Таблица 2.1.6.13.-2. - Приготовление растворов для испытания

Примечание.

f, f₁, f₂ - степень разведения раствора.

Раствор A - раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f, при котором было проведено испытание на мешающие факторы.

Раствор B - раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f₁, не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например 1:2 x максимально допустимое разведение (то есть разведение в два раза меньше, чем максимально допустимое разведение).

Раствор C - раствор испытуемого лекарственного средства в разведении f₂, не превышающем максимально допустимого разведения, выбранном после рассмотрения данных, полученных при валидации методики в отношении конкретного лекарственного средства, например максимально допустимого разведения.

Раствор AS - раствор A с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 x расчетный предел обнаружения для используемой системы (как определено в предварительном испытании).

Раствор BS - раствор B с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

Раствор CS - раствор C с добавлением стандартного образца эндотоксина в концентрации 2 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

Раствор R₀ - отрицательный контроль.

Раствор R₁ - стандартный образец эндотоксина в концентрации 0,5 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

Раствор R₂ - стандартный образец эндотоксина в концентрации 1 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

Раствор R₃ - стандартный образец эндотоксина в концентрации 2 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

Раствор R₄ - стандартный образец эндотоксина в концентрации 4 x расчетный предел обнаружения для используемой системы.

7.2.2. Вычисления и обработка результатов

Все результаты, включаемые в анализ данных, должны быть связаны с клетками, для которых среднее значение откликов на растворы R₀ - R₄ увеличиваются в прогрессии. Среднее значение откликов на R₀ может быть равным среднему значению откликов на R₁. Для каждого конкретного источника клеток среднее значение откликов на раствор R₂ должно быть больше положительного предельного значения. Результаты ниже этого положительного предельного значения рассматриваются как отрицательный отклик. Если среднее значение ответных реакций на R₁ или R₂ превышают предельное значение, то отклик на раствор, выбранный для оценки соответствия или несоответствия лекарственного средства требованиям, должен быть отрицательным (лекарственное средство выдерживает испытание).

Для определения открываемости (%) добавки для каждого отрицательного раствора испытуемого лекарственного средства (A, B и C) сравнивают среднее значение отклика соответствующих растворов с добавленным стандартным образцом эндотоксина (AS, BS или CS, соответственно) со средним значением отклика раствора R₃.

Если раствор испытуемого лекарственного средства, выбранный для оценки соответствия или несоответствия, и все разведения ниже его дают отрицательные результаты и определяемая концентрация добавленного стандартного образца эндотоксина находится в диапазоне от 50% до 200%, то концентрация пирогенного вещества в испытуемом лекарственном средстве меньше предельного содержания пирогенов для данного источника клеток.

7.2.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства

Критерии те же, что и для Метода 1 (см. раздел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи).

7.3. МЕТОД 3: СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ С КОНТРОЛЬНОЙ СЕРИЕЙ

При испытании методом 3 проводится сравнение испытуемого лекарственного средства с валидированной серией этого лекарственного средства, выбранной в качестве контрольной. Тип анализа, выбранный для их сравнения, должен быть обоснован и подтвержден для каждого лекарственного средства и должен включать критерии приемлемости. Контрольная серия также выбирается в соответствии с обоснованными и утвержденными критериями. Данное испытание предназначено для случаев, когда испытуемое лекарственное средство оказывает заметное мешающее действие, но не может быть разведено в диапазоне максимально допустимого разведения для его устранения, или предполагается, что лекарственное средство содержит неэндотоксиновые пирогены.

Реакции на неэндотоксиновые пирогены могут быть более быстрыми и выраженными, чем реакции на эндотоксины, что делает необходимым выполнение испытания в диапазоне разведений, включающем минимальное разведение. Процедура испытания описана в разделе 7.3.1 данной общей фармакопейной статьи и включает пример анализа, используемого для сравнения испытуемой серии с контрольной серией.

7.3.1. Процедура испытания

Используя валидированную методику испытания, готовят растворы, представленные в таблице 2.1.6.13.-3. Квалифицированные клетки культивируют с каждым из растворов в четырех повторностях.

Таблица 2.1.6.13.-3. - Приготовление растворов для испытания

Примечание.

f, f₁, f₂ - степень разведения раствора.

Растворы A, B и C - разведения контрольной серии в степенях разведения f, f₂ и f₃, определенных в испытании на мешающие факторы.

Растворы D, E и F - разведения испытуемого лекарственного средства в степенях разведения f₁, f₂ и f₃, определенных для контрольной серии в испытании на мешающие факторы.

Раствор G - положительный контроль жизнеспособности клеток; представляет собой раствор стандартного образца эндотоксина в концентрации, при которой наблюдается однозначная положительная реакция.

Раствор R₀ - растворитель, используемый для разведения испытуемого лекарственного средства; отрицательный контроль.

7.3.2. Вычисления и обработка результатов

Все результаты, включаемые в обработку данных, должны быть получены на клетках, у которых раствор G и хотя бы один из растворов A, B и C вызывал ответную реакцию, превышающую минимальный уровень высвобождения выбранного маркера (раствор R₀). Для каждого конкретного источника клеток, например, индивидуального донора, пула доноров или клеточной линии, используют кривую "доза - ответ" для маркера (калибровочная кривая в двух повторностях с отрицательным контролем и не менее 4 разведений стандарта маркера в геометрической прогрессии) и вычисляют среднюю величину реакций на растворы A - F.

Суммируют средние ответные реакции на растворы A, B и C и средние ответные реакции на растворы D, E и F. Делят сумму средних ответов на растворы D, E и F на сумму средних ответов на растворы A, B и C. Испытуемое лекарственное средство отвечает требованиям испытания для данного источника клеток, если полученное значение не превышает установленное значение критерия приемлемости, например 2,5.

7.3.3. Критерии соответствия или несоответствия лекарственного средства

Критерии те же, что и для метода 1 (см. раздел 7.1.3 данной общей фармакопейной статьи).

Для более точного количественного определения уровня контаминации методы 1, 2 и 3 могут выполняться с использованием других разведений раствора испытуемого лекарственного средства, не превышающих максимально допустимого разведения.

Следующий раздел

приводится для информации

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

1. ВВЕДЕНИЕ

Испытание на активацию моноцитов в первую очередь предназначено для использования в качестве замены испытания на Пирогенность. Испытание на активацию моноцитов позволяет обнаруживать пирогенные и провоспалительные вещества: эндотоксины грамотрицательных бактерий и пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, включая патоген-ассоциированные молекулярные паттерны грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов и грибов; химические вещества, характерные для лекарственного средства и/или образующиеся в процессе производства. Пирогенные вещества, отличные от эндотоксинов, представляют собой молекулы с разнообразными физико-химическими характеристиками, и обычно природа пирогена, присутствующего в испытуемом лекарственном средстве, неизвестна. Уровень содержания неэндотоксиновых пирогенов выражается или в эквиваленте единиц эндотоксина, полученным путем сравнения со стандартом эндотоксина или с серией испытуемого лекарственного средства, утвержденной в качестве контрольной.

В испытании на активацию моноцитов концентрации маркеров, образующихся в результате реакции на стандарт эндотоксина, обычно разводят приблизительно в 10 раз (на 1 lg) и при испытании лекарственных средств, содержащих неэндотоксиновые пирогены (только неэндотоксиновые пирогены или в комбинации с эндотоксинами), при определении их способности стимулировать моноциты часто получают очень крутые кривые "доза - ответ" (обычно лишь в диапазоне 1 или 2 степеней разведений). Чаще всего наибольшие ответные реакции на такие лекарственные средства получают при использовании неразведенных растворов или небольших разведений испытуемых лекарственных средств. По этой причине испытуемые растворы лекарственных средств, которые содержат или могут содержать неэндотоксиновые пирогены, должны испытываться в диапазоне разведений, который включает минимальное разведение.

2. МЕТОДЫ

2.1. Информация относительно выбора методов

Методы 1, 2 и 3 обычно не применяют в случаях, когда испытуемое лекарственное средство может активировать высвобождение выбранного маркера или когда одной из примесей в испытуемом лекарственном средстве является выбранный маркер. В обоих случаях эти обстоятельства должны привести к модификации и валидации выбранного метода.

Предполагается, что при валидации выбранного метода в отношении маркера будут определены:

- частота отсутствия реакции на соответствующую комбинацию лекарственного средства с пирогенными примесями;

- выбор мер по обеспечению надежности результатов испытаний, например, скрининг доноров, увеличение числа доноров, у которых получают клетки для каждого испытания;

- установление достаточно строгих критериев соответствия или несоответствия для максимального увеличения вероятности обнаружения серий лекарственных средств, содержащих существенное количество пирогенов.

Метод 1 подходит для испытания, если результаты различных разведений (эквивалент эндотоксина на миллилитр) показывают, что кривая "доза - ответ" параллельна калибровочной кривой стандартного образца эндотоксина.

Метод 2 является полуколичественным испытанием, который можно применять, когда ответные реакции на разведения испытуемого лекарственного средства не параллельны ответным реакциям на разведения стандартного образца эндотоксина.

Метод 3 - сравнительное испытание с контрольной серией испытуемого лекарственного средства. Метод 3 подходит для случаев со значительной индивидуальной вариабельностью реакций донорских клеток на определенные комбинации лекарственных средств с пирогенами. Следует отметить, что реакция моноцитов большинства доноров на бактериальный эндотоксин приблизительно одинакова, тогда как реакции моноцитов отдельных доноров на неэндотоксиновые пирогены могут существенно различаться, что позволяет идентифицировать клетки "не реагирующие на неэндотоксиновые пирогены" и клетки со "слабой" и "сильной" реакцией на определенные комбинации лекарственных средств и пирогенных веществ.

2.2. Вычисление предельной концентрации пирогена

Критерием приемлемости для принятия решения о соответствии или несоответствии является предельное содержание пирогена, которое выражается в эквивалентах эндотоксина на миллиграмм или миллилитр или на единицы биологической активности испытуемого лекарственного средства. Если предельное содержание эндотоксина для лекарственного средства установлено, то предельное содержание пирогена будет равно предельному содержанию эндотоксина, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Предельное содержание пирогена выражают в эквивалентах эндотоксина и рассчитывают по формуле:

где: K - предельная пирогенная доза бактериального эндотоксина из расчета на килограмм массы тела;

M - максимальная разовая доза испытуемого лекарственного препарата из расчета на килограмм массы тела.

В случае введения лекарственного препарата через частые интервалы или инфузионно, в качестве "M" используют общую максимальную дозу, вводимую в течение одного часа.

Предельное содержание пирогена зависит от лекарственного препарата, пути его введения и представлено в некоторых частных фармакопейных статьях.

Значения для предельной пирогенной дозы бактериального эндотоксина на килограмм массы тела (K) приведены в таблице 2.1.6.13.-4.

Таблица 2.1.6.13.-4. - Предельные пирогенные дозы бактериального эндотоксина

2.3. Информация относительно криоконсервантов

Следует учитывать воздействие криоконсервантов, например диметилсульфоксида (ДМСО), и их остаточных количеств на размороженные клетки: ДМСО обладает токсичностью и может изменять свойства клеток, в частности, проницаемость клеточных мембран, даже после тщательной отмывки размороженной клеточной взвеси.

2.4. Испытание на мешающие факторы

В случаях, когда это практически осуществимо, проводят испытание на мешающие факторы по крайней мере трех различных серий испытуемого лекарственного средства. Испытуемые лекарственные средства, у которых отмечается значительная вариабельность реакций от серии к серии, должны подвергаться испытанию на мешающие факторы в рамках каждого индивидуального испытания, то есть сопутствующей валидации.

Испытание на мешающие факторы в большинстве случаев выполняют на сериях испытуемого лекарственного средства, которые не содержат эндотоксинов и других пирогенов, но, если это невозможно, на сериях с минимальным содержанием пирогенов. Если имеется только одна серия испытуемого лекарственного средства, валидация должна выполняться на этой серии в трех независимых испытаниях. Должны выполняться параметры прецизионности для воспроизводимости, например 50%.

2.5. Перекрестная валидация

В общей фармакопейной статье 2.1.6.21. Применение испытания на бактериальные эндотоксины указано, что испытание на активацию моноцитов следует проводить для лекарственных средств, где нельзя исключать присутствие неэндотоксиновых пирогенов. Исходя из этого, рекомендуется проводить эксперименты перекрестной валидации испытаний на активацию моноцитов вместе с экспериментами испытаний на бактериальные эндотоксины, используя те же три серии. В случае изменения критических параметров процесса перекрестная валидация должна быть повторена на трех сериях, поскольку потенциальное загрязнение неэндотоксиновыми пирогенами не может быть исключено.

Испытание на присутствие пирогенов, проводимое на кроликах (2.1.6.2), должно выполнять только для перекрестной валидации, если ни один из методов испытания на активацию моноцитов (метод 1, метод 2 или метод 3) не может быть подтвержден для определенного лекарственного средства.

3. ЗАМЕНА ИСПЫТАНИЯ ПИРОГЕННОСТЬ НА ИСПЫТАНИЕ НА АКТИВАЦИЮ МОНОЦИТОВ

Испытание на активацию моноцитов прежде всего предназначено для использования в качестве замены испытания пирогенность на кроликах. Частные фармакопейные статьи могут содержать требования проведения испытания на бактериальные эндотоксины, пирогенность или испытание на активацию моноцитов.

Общие принципы:

- в любой частной фармакопейной статье, при наличии требований к содержанию пирогенных веществ, указывается только одно испытание: испытание на бактериальные эндотоксины, пирогенность или испытание на активацию моноцитов. Перед включением испытания на активацию моноцитов в частную фармакопейную статью требуется подтверждение пригодности одного из трех методов, указанных в общей фармакопейной статье 2.1.6.13. Испытание на активацию моноцитов, для оценки лекарственного средства, являющегося предметом данной частной фармакопейной статьи;

- необходимая информация предоставляется производителями.

Производителям предлагается предоставить любые подтверждающие данные, относящиеся к применимости испытания на активацию моноцитов для контроля активных фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов. Такие данные включают подробное описание приготовления образцов и любых процедур по удалению мешающих факторов. Дополнительно требуются любые доступные данные по параллельному испытанию продукта на Пирогенность, обосновывающие целесообразность замены испытания на пирогенность на испытание на активацию моноцитов.

4. ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДИК

Замена испытания Пирогенность или метода определения провоспалительных или пирогенных веществ на другой метод должны рассматриваться как использование альтернативной методики при замене фармакопейного метода согласно требованиям, представленным в разделе 1. Общие сведения Фармакопеи Союза.

Для валидации методики испытания на активацию моноцитов, отличной от описанной в общей фармакопейной статье, предполагается соблюдение следующих требований:

- процедура, материалы и реактивы, используемые в испытании, должны быть валидированы в соответствии с рекомендациями для данного испытания;

- испытание на присутствие мешающих факторов (и, если необходимо, процедура по их устранению) выполняется на образцах не менее трех производственных серий.

201060014-2023

2.1.6.14. МИКОБАКТЕРИИ

Общая фармакопейная статья распространяется на метод определения микобактерий.

Если испытуемый образец может содержать микроорганизмы, отличные от микобактерий, его обрабатывают подходящим деконтаминирующим раствором, например, раствором ацетилцистеина и натрия гидроксида или раствором натрия лаурилсульфата.

На каждую из двух подходящих твердых питательных сред (например, среда Левенштейна-Йенсена или среда Миддлбрук 7Н10) инокулируют по 0,2 мл испытуемого образца. Испытание выполняют в трех повторностях. В подходящую жидкую питательную среду также в трех повторностях инокулируют по 0,5 мл испытуемого образца. Все среды инкубируют при температуре 37 °C в течение 56 сут.

Определяют способность среды обеспечивать рост микобактерий в присутствии испытуемого образца путем инокуляции подходящего штамма семейства Mycobacteriaceae, например, БЦЖ, и, при необходимости, используют подходящий нейтрализующий агент.

Если в течение первых восьми суток инкубации наблюдают рост посторонних микроорганизмов, испытание повторяют с одновременным проведением испытания на бактериологическую стерильность.

Испытуемый образец выдерживает испытание, если в конце инкубационного периода ни в одной из пробирок не наблюдают рост микобактерий.

201060015-2023

2.1.6.15. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом и нековалентном связывании антигенов антителами. Данные методы используют для обнаружения или количественного определения как антигенов, так и антител. Комплекс антиген-антитело можно идентифицировать и количественно определить различными методами. Положения общей фармакопейной статьи относятся к иммунохимическим методам с использованием реактивов с меткой или без метки.

Результаты, получаемые иммунохимическими методами, зависят от экспериментальных условий, характера и качества используемых реактивов. Важно стандартизировать компоненты иммунохимического анализа и по возможности использовать для количественных определений международные стандартные образцы.

Для проведения иммунохимических исследований обычно используют коммерчески доступные наборы, включающие реактивы (в частности, антиген или антитело) и материалы, предназначенные для оценки in vitro конкретной субстанции, а также инструкции по их применению. Наборы используют в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием необходимо убедиться, что селективность и чувствительность наборов являются подходящими для анализа конкретной субстанции.

Общая фармакопейная статья включает также следующее понятие:

набор (реактивов) - комплект специально подобранных реактивов, составных частей и инструкций по проведению анализа, предназначенный для определения in vitro одного конкретного вещества, возбудителя (или активности фермента), нескольких конкретных веществ, возбудителей (или суммарной активности ферментов), а также для детекции участка генома. Совокупность компонентов, которые упакованы вместе и предназначены для выполнения специфического исследования in vitro. Компоненты набора реактивов могут включать в себя реактивы (антитела, ферменты, буферные и питательные растворы, разбавители), калибраторы, контрольные материалы и другие материалы.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

В методах с использованием меченых антигенов или антител могут применяться различные метки, например, ферментные, флуоресцентные, люминесцентные и радиоизотопные.

При использовании в качестве метки радиоизотопа метод называют радиоиммунным. Рекомендации по измерению радиоактивности, приведенные в общей фармакопейной статье 2.3.20.2. Радиофармацевтические лекарственные препараты, подходят также и для иммунологических методов с использованием радиоизотопов. Все работы с радиоактивными материалами должны выполняться в соответствии с законодательством государств - членов Союза и международными документами по защите от радиационной опасности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

МЕТОДЫ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ

Методы иммунопреципитации включают флокуляцию и преципитацию. При смешивании раствора антигена с соответствующим антителом в определенных условиях образуются флокулирующие или преципитирующие агрегаты. Соотношение концентраций реактивов, обеспечивающее наименьшее время флокуляции или наиболее выраженную преципитацию, называют оптимальным соотношением. Такое соотношение обычно получают при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Иммунопреципитацию оценивают визуально или с помощью методов светорассеяния (нефелометрия или турбидиметрия). Для повышения чувствительности в качестве реактивов можно использовать частицы (например, из латекса), покрытые антигенами или антителами.

В методах флокуляции обычно используют пошаговое разведение одного из реактивов, а в методах иммунодиффузии разведение происходит в процессе диффузии в гель и таким образом достигают градиента концентраций одного или обоих реактантов. При этом в геле образуются зоны с соотношением реактантов, оптимальным для преципитации. Постановку реакции флокуляции выполняют в пробирках, тогда как в методах иммунодиффузии используют различные носители: пробирки, планшеты, предметные стекла, ячейки или камеры.

Системы иммунопреципитации могут быть простыми, комплексными и множественными. Простая система состоит из одного антигена в сочетании с соответствующим антителом; комплексная - из родственных, но серологически неидентичных реактантов, множественная - из нескольких серологически неродственных реактантов.

В методах простой диффузии градиент концентрации устанавливают только для одного реактанта, диффундирующего из внешнего источника в гель, который содержит соответствующий реактант в сравнительно низкой концентрации.

Простая (одиночная, радиальная) иммунодиффузия - количественный метод, при котором антиген (антитело), диффундируя в гель, образует кольцо преципитации с соответствующим ему антителом (антигеном). При достижении равновесия между антигеном и антителом, площадь образовавшегося кольца преципитации прямо пропорциональна содержанию антигена (антитело) и обратно пропорциональна содержанию антитела (антигена) в геле.

В методах двойной диффузии градиенты концентрации устанавливают для обоих реактантов. И антиген, и антитело из различных участков диффундируют в первоначально иммунологически нейтральный гель.

Методы сравнительной двойной диффузии используют для качественного сравнения различных антигенов по отношению к подходящему антителу или наоборот. Сравнение основано на наличии или отсутствии взаимодействия между компонентами преципитации. Реакции идентичности, неидентичности и частичной идентичности антигенов (антител) могут быть различными.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Иммуноэлектрофорез (ИЭ) - качественный метод, сочетающий гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией.

Перекрестный иммуноэлектрофорез является модификацией метода иммуноэлектрофореза и подходит как для количественного, так и качественного анализа. Первая часть метода представляет собой гель-электрофорез, после которого продольные полоски геля, содержащие разделенные фракции, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно к предыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем сравнительно низкие концентрации антител, соответствующих антигену. Зависимость между площадью пиков преципитации и количеством соответствующего антигена является линейной для данной концентрации антитела и толщины геля.

Электроиммунный анализ, часто называемый ракетным иммуноэлектрофорезом, является быстрым методом количественного определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот. Электрофорез определяемого антигена выполняют в геле, содержащем относительно низкие концентрации соответствующих антител. Испытуемый образец и разведения стандартного антигена, используемые для калибровки, вносят в разные лунки в геле. В процессе электрофореза образуются мигрирующие зоны преципитации в виде пиков, которые увеличиваются до тех пор, пока сохраняется избыток соответствующего антигена. Для данной концентрации антител зависимость между высотой пика преципитации и количеством антигена является линейной.

Встречный иммуноэлектрофорез - быстрый метод количественного определения, при котором градиент концентрации устанавливается между вносимыми антителом и антигеном в зависимости от заряда под действием постоянного электрического поля. Стандартные растворы для калибровки и разведения испытуемого образца вносят в лунки одного ряда в геле, а в лунки противоположного ряда вносят разведения соответствующего реактанта с известной концентрацией. Титром испытуемого образца считают наибольшее разведение, при котором образуется линия преципитации.

Существует ряд модификаций методов перекрестного иммуноэлектрофореза и электроиммунного анализа.

Другие методы сочетают разделение антигенов по размеру молекул и серологическим свойствам.

ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ

Выявление и характеристику линий иммунопреципитации выполняют путем селективного или неселективного окрашивания с использованием флуоресцентных, ферментных или изотопных меток или другими подходящими методами. Методы селективного окрашивания в преципитатах обычно используют для определения характеристик веществ небелковой природы.

При подходящей концентрации каждого из реактантов в полупрозрачных гелях, например, агаре или агарозе, линии преципитации четко различимы невооруженным глазом.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА

КРИТЕРИИ ВАЛИДАЦИИ

Методики считаются приемлемыми, если:

- антитело и антиген не имеют существенных отличий в стандартном и испытуемом образцах. В случае меченых реактивов различия между меченым и немеченым компонентами соответствующего реактива незначительны;

- на результат испытания не оказывает влияния матрица (любой компонент испытуемого образца или вспомогательные вещества, которые могут быть различными в разных образцах);

- результат количественного определения не выходит за пределы критериев приемлемости, указанных в частной фармакопейной статье;

- прецизионность количественного определения достаточна для выполнения требований, указанных в частной фармакопейной статье;

- порядок выполнения количественного определения не увеличивает систематические ошибки.

МЕТОДИКИ ВАЛИДАЦИИ

Для подтверждения соответствия критериям приемлемости валидация должна включать:

- проведение испытания в не менее трех повторностях;

- проведение испытания не менее чем на трех различных разведениях стандартных образцов и трех разведениях испытуемых образцов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца;

- использование рандомизации;

- приготовление стандартного образца аналогичным образом, если испытуемый образец находится в сыворотке или в смеси с другими компонентами;

- измерение неспецифического связывания меченого реактанта;

- для заместительного иммунного анализа:

- определение максимального связывания (нулевое замещение);

- использование разведений, охватывающих весь диапазон откликов от значений, близких к неспецифическому связыванию, до значений максимального связывания как для стандартных образцов, так и испытуемого образца.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА

Для анализа результатов испытаний могут быть использованы методы, представленные в общей фармакопейной статье 2.3.12.0. Статистическая обработка результатов биологических испытаний лекарственных средств.

Существенное отклонение от параллелизма указывает на то, что между антителом и антигеном в испытуемом и стандартном образцах имеются различия, и результаты испытания являются незначимыми.

Для заместительного иммунологического анализа не должно быть существенных различий между значениями неспецифического связывания и максимального замещения при высокой концентрации испытуемого и стандартного образцов. Различия могут указывать на наличие эффектов, обусловленных матрицей, ингибированием связывания или разложением метки.

201060016-2023

2.1.6.16. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ

Принцип проточной цитометрии (цитофлуориметрии) заключается в многопараметрическом исследовании оптических свойств отдельных частиц в проточной жидкой системе.

Клетки или частицы в суспензии индивидуально распределяются в линейном потоке, протекающем через измерительное устройство. Для проведения анализа плотные ткани необходимо преобразовать в суспензию отдельных клеток.

С помощью проточной цитометрии определяют широкий спектр параметров: объем и морфологическую структуру клеток, клеточные пигменты, содержание ДНК и РНК, белки, поверхностные клеточные маркеры, внутриклеточные маркеры, ферментативную активность, значение pH, состояние мембраны, текучесть и т.д.

Проточная цитометрия позволяет определять для каждой отдельной клетки два морфологических параметра и один или более сигналов флуоресценции. Многопараметрический анализ позволяет определить фенотип клеточной популяции.

ПРИБОР

Фокусировка, усиление сигнала и выбор источника света должны быть оптимизированы для автоматического обнаружения и измерения морфологических различий и особенностей окрашивания. При выполнении метода проточной цитометрии проводят:

- выбор источника света в зависимости от параметров, которые будут проанализированы;

- настройку цитометра в зависимости от типа анализируемых клеток (например, клеточные культуры, лейкоциты, тромбоциты, бактерии, сперматозоиды, дрожжи) и целей анализа (например, фенотипирование, определение клеточного цикла, апоптоза, цитокинов, мембранной текучести, флуоресцентного белка).

Для проточной цитометрии характерно автоматизированное количественное определение ряда заданных параметров для большого числа единичных клеток в течение каждого анализа. Например, 100 000 частиц или более (фактически неограниченное количество) анализируются одна за другой, как правило, приблизительно в течение 1 мин. Предел обнаружения составляет 100 флуоресцентных молекул на клетку.

Прибор для проточной цитометрии (проточный цитометр, проточный цитофлуориметр) имеет пять основных блоков:

- система подачи растворов и проточная ячейка;

- источник света;

- система обнаружения (детектирование сигнала) и система аналого-цифрового преобразования;

- система усиления (амплификации);

- компьютер с программным обеспечением для анализа сигналов.

СИСТЕМА ПОДАЧИ РАСТВОРОВ И ПРОТОЧНАЯ ЯЧЕЙКА

С помощью системы подачи растворов клетки переносят в проточную ячейку, где они под воздействием обжимающей жидкости распределяются в линию по одному за счет гидродинамического фокусирования (поток в потоке) и пересекают пучок световых лучей. Детектирование клеток в канале проточной ячейки, через который проходят клетки, происходит с помощью луча света, сфокусированного в эллипсоидном пространстве двумя конфокальными линзами. Для подсчета поверхностных клеточных маркеров скорость потока во время анализа должна быть постоянной и обеспечивать подходящее расстояние между клетками.

ИСТОЧНИКИ СВЕТА

Наиболее часто используют следующие источники света:

- лампы (ртутная, ксеноновая);

- лазеры большой мощности, охлаждаемые водой (аргоновый, криптоновый, лазер на красителях);

- лазеры низкой мощности, охлаждаемые воздухом (аргоновый (488 нм), красный гелий-неоновый (633 нм), зеленый гелий-неоновый, гелий-кадмиевый (ультрафиолетовый));

- полупроводниковые (диодные) лазеры (синий, зеленый, красный, фиолетовый).

ДЕТЕКТИРОВАНИЕ СИГНАЛА

Когда частица проходит через пучок света, она рассеивает часть света во всех направлениях. Флуоресцентные красители, добавленные к частице, испускают свой собственный свет (флуоресценцию), которая также излучается во всех направлениях. Таким образом, генерируются два типа сигнала: рассеяние света и эмиссия флуоресценции.

Световые датчики прибора фокусируют часть этого рассеянного света и флуоресценции и преобразуют в электрические импульсы пропорционально количеству собранного света.

Светорассеяние

Измеряют 2 параметра:

- прямое рассеяние;

- боковое рассеяние, под углом 90° к направлению пучка света.

Прямое светорассеяние коррелирует с объемом клетки, в то время как боковое светорассеяние, связанное с такими параметрами, как форма ядра, количество и тип цитоплазматических гранул или шероховатость мембран, коррелирует с морфологическим строением клетки. С возрастанием сложности клеточной структуры интенсивность бокового светорассеяния также возрастает.

Сигналы светорассеяния, являющиеся функцией морфологических характеристик клеток и определяющиеся как базовые параметры, при анализе с помощью проточной цитометрии будут генерироваться всегда.

Флуоресценция

При прохождении частиц через лазерный луч они будут испускать определенный флуоресцентный свет, в зависимости от типа и количества источников света. Излучение флуоресцентных сигналов происходит благодаря флуоресцентным красителям, естественно находящимся в клетках (например, коферменты, хлорофилл, пигменты морской водоросли), и (или) флуоресцентным зондам, использованным для маркировки клеток для определения специфичных характеристик (например, флуоресцирующие антитела, красители нуклеиновых кислот, pH-метки и кальций-зависимые метки, флуоресцирующие белки). Каждая флуоресцентная метка характеризуется индивидуальным спектром возбуждения и спектром эмиссии, ее выбирают в зависимости от природы источника возбуждения, системы обнаружения и специфической цели анализа. Оптические фильтры должны соответствовать используемым флуорофором.

УПРАВЛЕНИЕ СИГНАЛОМ И АНАЛОГО-ЦИФРОВОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ

Сигналы светорассеяния и флуоресценции, испускаемые клетками при прохождении через лазерный луч, разделяются и направляются к детекторам с помощью оптических фильтров. Детекторы являются трансдукторами (фотоэлектронными умножителями), которые преобразуют световое излучение, генерируемое клетками, в импульсы напряжения.

Процесс подсчета каждого импульса в соответствующем канале является аналого-цифровым преобразованием. Процесс отображается графически в виде частотной гистограммы.

Усиление (амплификация)

Для оптимальной визуализации импульсы напряжения должны быть усилены. Процесс усиления подчеркивает различия между сигналами клетки и, следовательно, увеличивает разрешение между популяциями клеток с различными характеристиками (например, отличие жизнеспособных от нежизнеспособных клеток, или неспецифической флуоресценции от антиген-специфической флуоресценции после окраски мечеными моноклональными антителами).

Есть два метода усиления сигнала: линейный и логарифмический. Выбор между двумя типами делают для каждого отдельного сигнала в соответствии с морфологическими характеристиками клеток и используемыми красителями (например, флуоресцентно-меченые моноклональные антитела, красители нуклеиновой кислоты).

Линейное усиление увеличивает различия среди интенсивных импульсов, то есть используется с теми параметрами, которые производят сигналы высокой интенсивности, например:

- параметры светорассеяния клетки;

- флуоресценция красителей нуклеиновых кислот при изучении клеточного цикла.

Логарифмическое усиление, напротив, предназначено для слабых импульсов и параметров или аналитических условий, которые могут произвести как слабый, так и сильный импульс, например:

- антигены клетки;

- светорассеяние от тромбоцитов, бактерий, дрожжей;

- флуоресценция от красителей нуклеиновых кислот при исследовании апоптоза.

Компенсация сигналов флуоресценции

У каждого флуоресцирующего красителя есть определенный спектр поглощения и спектр эмиссии. При использовании для окрашивания клеток двух или более флуоресцентных меток одновременно (например, иммунное фенотипирование по четырем антигенам), спектры эмиссии флуорофоров могут перекрываться. Как следствие, каждый детектор флуоресценции зарегистрирует как определенную флуоресцентную метку, так и какое-то количество света, излучаемого другими флуоресцентными метками. Это может привести к завышению сигнала и плохому разделению популяций клеток.

Использование электронной матрицы позволяет селективно разделять перекрестные сигналы после их улавливания детектором (компенсация флуоресценции).

Для компенсации флуоресценции требуется использование калибраторов флуоресценции, при этом предпочтительно использование положительных образцов клеток, меченных необходимыми флуорофорами, присоединенными тем же способом, что и к антителам, используемым для анализа.

ОТОБРАЖЕНИЕ СИГНАЛОВ

После усиления и компенсации сигналы отображаются в виде двух- или трехмерных гистограмм. Гистограммы показывают зависимость интенсивности сигнала от количества событий для данного параметра. Гистограммы, в которых каждая точка представляет клетку, основаны на комбинации двух сигналов (двухмерные точечные диаграммы с двумя параметрами). Тип и число распределений и комбинаций сигналов выбирают в зависимости от образцов клеток и использованных меток. При анализе полученных данных программное обеспечение для проточной цитометрии может также генерировать и другие виды графических изображений (такие, как накладывания, поверхностные гистограммы, томограммы (срезовые гистограммы), контурные гистограммы, гистограммы плотности или интенсивности, накладывающиеся гистограммы). Также могут быть использованы статистические данные, такие как средние интенсивности флуоресценции (и их изменения по времени или в зависимости от функции клетки).

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Клеточная суспензия для испытания может содержать различные виды объектов, некоторые из которых нежелательны (такие, как нежизнеспособные клетки, фрагменты клеток или макроагрегаты) или просто не являются целью анализа (например, гранулоциты при изучении лимфоцитов). Это зависит от типа образца (цельная кровь, костный мозг, клеточные культуры, биологические жидкости, клеточные суспензии из плотных тканей) и процедуры обработки (например, методы окрашивания, лизиса (эритроцитов), фиксации, криоконсервирования, размораживания, депарафинирования).

Как следствие, не все сигналы, генерируемые во время анализа, принадлежат изучаемым клеткам. Для исключения нежелательных и несоответствующих сигналов применяют два подхода.

Первый подход, который применяют в процессе накопления данных, представляет собой установление шумового порога для одного (или более) существенного параметра (параметров). Данный подход регулирует включение в анализ только клеток, интенсивность сигнала которых выше, чем предопределенное дискриминирующее (пороговое) значение для данного параметра. Параметр прямого светорассеяния чаще всего используют в качестве дискриминатора (фактора разделения) из-за его высокоинтенсивного сигнала с низким уровнем интерференции.

Второй подход, который применяют при анализе данных, заключается в процедуре гейтирования, ограничивая анализ только сигналами от тех популяций клеток, которые удовлетворяют определенным морфологическим и экспрессионным (по флуоресценции) профилям. Обычно используют 2 типа гейтирования. Первый тип основан на морфологии клеток. Клеточные популяции идентифицируют по их морфологическим характеристикам (определяемым с помощью прямого светорассеяния и бокового светорассеяния). Область гейтирования определяет границы представляющей интерес популяции (например, лимфоциты, жизнеспособные клетки), после чего графики флуоресценции отображаются только для выбранной области. Второй тип селекции сигнала основан на флуоресценции. Интересующую клеточную популяцию идентифицируют на основании интенсивности экспрессии антигена или красителя, затем определяют область гейтирования. Затем в рамках выбранной области строят графики флуоресценции. Соответствующее программное обеспечение позволяет создавать множественные области гейтирования, используя последовательный логический порядок. Это особенно информативно при изучении редких популяций клеток или при сортировке клеток.

КОНТРОЛИ

Внутренний контроль

Перед испытанием должна быть проведена настройка оптической системы с использованием подходящих флуоросфер, а также проверена стабильность проточной системы. По полученным данным формируют отчет и используют при проведении периодического контроля. Для доказательства того, что используемые в испытании антитела функциональны и позволяют надлежащим образом использовать проточный цитометр, применяют положительный контроль, в который должны быть включены образцы, известные как положительные для интересующего маркера.

Внешний контроль

Рекомендуется участвовать в межлабораторных испытаниях для подтверждения надежности полученных данных или проверки межлабораторной воспроизводимости.

201060017-2023

2.1.6.17. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на следующих подходах:

- амплификация целевого фрагмента нуклеиновой кислоты с использованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР) или изотермической амплификации рибонуклеиновой кислоты (РНК);

- амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, метода разветвленной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); в этом случае амплификация сигнала достигается без повторяющихся циклов амплификации нуклеиновой кислоты.

В общей фармакопейной статье описаны требования к методам амплификации нуклеиновых кислот на примере типичного метода ПЦР для последующего детектирования амплифицированных фрагментов ДНК подходящим методом. Фрагменты РНК после обратной транскрипции в комплементарную ДНК и последующей амплификации полученного фрагмента ДНК могут быть детектированы подходящим методом.

Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот могут применяться при условии, что они соответствуют требованиям к качеству испытаний, приведенным в данной общей фармакопейной статье.

Общая фармакопейная статья устанавливает требования к подготовке образца, амплификации in vitro фрагментов ДНК и детектированию специфического продукта ПЦР.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Типичная ПЦР представляет собой трехстадийную циклическую процедуру, позволяющую проводить in vitro амплификацию определенных фрагментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции в комплементарную ДНК).

Основные стадии амплификации ДНК включают:

- денатурацию двуцепочечной нуклеиновой кислоты (матричной ДНК, фрагментов ДНК), когда двуцепочечная ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние;

- специфический отжиг праймеров (синтетических олигонуклеотидов противоположной направленности, фланкирующих целевой участок ДНК) с комплементарным участком молекулы ДНК в подходящих реакционных условиях;

- элонгацию нуклеотидной цепи, комплементарной матричной, путем достраивания второй цепи ДНК с 3'-конца праймера под воздействием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез фрагментов ДНК).

В дальнейшем повторяющиеся стадии денатурации, специфического отжига и элонгации ведут к получению и накоплению амплифицируемого фрагмента, ограниченного праймерами с двух концов.

Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть детектирован различными методами соответствующей специфичности и чувствительности.

Мультиплексная ПЦР проводится с использованием нескольких пар праймеров, сконструированных для одновременной амплификации различных целевых фрагментов ДНК в одной реакции.

ИСПЫТУЕМЫЙ ОБРАЗЕЦ

В связи с высокой чувствительностью ПЦР испытуемые образцы должны быть оптимальным образом защищены от внешней контаминации нуклеиновыми кислотами и ампликонами. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого образца производят в условиях, минимизирующих разрушение матричной ДНК. В случае проведения испытания по определению матричной РНК необходимо принять особые меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воздействию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реактивы, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на ход определения.

МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЯ

ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ КОНТАМИНАЦИИ

В связи с риском контаминации следует строго разграничивать рабочие зоны в зависимости от используемых материалов и применяемой технологии, учитывать передвижение персонала, использование средств индивидуальной защиты, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.

При проведении испытания следует разделять такие зоны, как:

- зона первичной подготовки (зона, в которой работы осуществляют только с материалами, не содержащими нуклеиновых кислот, способных быть матрицей, например, с праймерами, буферными растворами и др.);

- зона для пробоподготовки (зона, в которой осуществляют работу с реактивами, образцами и др.);

- зона ПЦР-амплификации (зона, в которой амплифицируемый материал обрабатывается в закрытой системе);

- зона детектирования (единственная зона, в которой операции с амплифицируемым материалом производятся в открытой системе).

В случае использования закрытой системы строгое разделение зон не обязательно.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ

Для подготовки образцов к постановке ПЦР используют различные физико-химические процедуры экстракции и (или) обогащения. Подлежащая амплификации целевая ДНК должна быть экстрагирована или высвобождена из испытуемого материала таким образом, чтобы амплификация в выбранных реакционных условиях была осуществима. Используемая методика должна быть эффективной и воспроизводимой.

Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влияние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует использовать образцы для внутреннего контроля, описанные в разделе Контрольные образцы для проверки правильности хода испытания данной общей фармакопейной статьи.

В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению проявления рибонуклеазной активности.

АМПЛИФИКАЦИЯ

Амплификацию целевого фрагмента нуклеиновой кислоты методом ПЦР проводят при оптимальных для каждого цикла заданных условиях (температурный профиль для денатурации двуцепочечной ДНК, отжига и элонгации, время инкубации при выбранных температурах, скорость элонгации). Эти условия зависят от различных параметров, например:

- длины и состава праймера и целевого фрагмента;

- типа ДНК-полимеразы, состава буферной смеси и реакционного объема, используемых при амплификации;

- типа используемого устройства для амплификации и показателей теплопроводности между прибором, реакционной емкостью и реакционной смесью.

ДЕТЕКТИРОВАНИЕ

Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, можно идентифицировать по размеру, последовательности нуклеотидов, химической модификации или комбинации этих параметров. Для обнаружения и определения размера фрагмента могут быть использованы методы гель-электрофореза (с использованием агарозного или полиакриламидного гелей или капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (например, жидкостной хроматографии). Для обнаружения и определения характеристик последовательности нуклеотидов могут быть использованы специфическая гибридизация зондов, содержащих комплементарную мишени последовательность нуклеотидов, или расщепление амплифицированного материала, отражающее наличие мишень-специфических сайтов ферментативной рестрикции. Для обнаружения и определения характеристик химической модификации может быть использовано, например, введение в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуоресценции, возникающей в результате возбуждения.

Детектирование ампликонов может быть достигнуто с помощью зондов, помеченных для последующего хемилюминесцентного, радиоизотопного или иммуноферментного детектирования.

ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат испытания является достоверным лишь при условии получения однозначно положительных результатов для образцов положительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для образцов отрицательного контроля (контролей). В связи с исключительно высокой чувствительностью метода ПЦР и риском контаминации положительные результаты должны подтверждаться двукратным полным повторением процедуры испытания по возможности с новой аликвотой образца. Образец считается положительным, если хотя бы одно из двух повторных испытаний дает положительный результат.

При определении нуклеиновой кислоты, для которой установлен измеримый предел количественного определения, необходимо использовать методики для количественного определения.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР

Программа валидации должна включать квалификацию оборудования. Следует учитывать положения, изложенные в общей фармакопейной статье 2.3.14.0. Валидация аналитических методик.

Для валидации ПЦР-испытания применяют подходящие стандартные образцы предприятия, калиброванные относительно международных стандартных образцов целевой последовательности нуклеотидов, если применимо.

Определение наименьшего положительного значения

При валидации испытания должно быть установлено наименьшее положительное значение, определяемое как минимальное количество целевых матричных нуклеиновых кислот в объеме образца, которые могут быть обнаружены в 95% испытаний. Наименьшее положительное значение зависит от таких взаимосвязанных факторов, как объем экстрагированного образца и эффективность методологии экстракции, транскрипция целевой РНК в комплементарную ДНК, процесс амплификации и детектирования.

При определении предела обнаружения системы следует учитывать наименьшие положительные значения для каждой целевой матричной нуклеиновой кислоты и результаты проведения испытания выше и ниже этих значений.

Системы для количественного определения

При валидации проводится оценка методики количественного определения по следующим характеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, предел количественного определения, линейность, диапазон применения и устойчивость (робастность) аналитической методики.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕАКТИВОВ

Все реактивы, имеющие критическое значение для используемой методики, должны проходить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность должна основываться на заранее установленных критериях качества.

Праймеры являются важнейшими компонентами испытаний методом ПЦР, поэтому следует уделять особое внимание их строению, чистоте и пригодности для испытаний. Праймеры могут быть модифицированы (например, конъюгированием с флуорофором или антигеном) для возможности детектирования ампликона специфическими методами при условии, что такие модификации не приведут к ингибированию правильного и эффективного протекания процесса амплификации целевого фрагмента.

КОНТРОЛЬНЫЕ ОБРАЗЦЫ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ПРАВИЛЬНОСТИ ХОДА ИСПЫТАНИЯ

Образцы для внешнего контроля

При постановке ПЦР для минимизации риска контаминации и обеспечения соответствующей чувствительности при каждом испытании используют следующие внешние контрольные образцы:

- образец положительного контроля: образец содержит определенное количество копий целевого фрагмента, близкое к пороговому наименьшему положительному значению, установленное индивидуально для каждой системы и выраженное кратно по отношению к наименьшему положительному значению данной системы;

- образец отрицательного контроля: образец, аналогичный основной матрице, для которой доказано отсутствие целевой последовательности нуклеотидов. Используется для выявления ложноположительного сигнала.

Образцы для внутреннего контроля

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье образцы для внутреннего контроля представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содержащие сайты связывания с праймерами (праймеры для таких последовательностей добавляются в реакционную смесь дополнительно).

Образцы для внутреннего контроля должны амплифицироваться так же эффективно, как и испытуемая последовательность нуклеотидов, но ампликоны должны иметь четко определяемые отличия. Тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом образце.

Образцы для внутреннего контроля предпочтительно добавлять к испытуемому образцу до выделения нуклеиновой кислоты; чтобы можно было их использовать для общего контроля процесса (экстракция, обратная транскрипция, амплификация, детектирование).

Образец для контроля предела количественного определения

Для контроля предела количественного определения готовят образец, содержащий концентрацию определяемого компонента в испытуемом образце, максимально близкую, но не превышающую пороговую линию. Образец для контроля предела количественного определения содержит компонент, калиброванный предпочтительно в международных единицах, и используется параллельно при каждом количественном определении.

ВНЕШНЯЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА

Участие во внешних программах оценки качества представляет собой важную процедуру обеспечения качества испытания методом ПЦР для каждой лаборатории и каждого аналитика.

Следующие разделы

приводятся для информации.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА C В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Большинство аналитических методик, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, представляют собой испытания на наличие нуклеиновых кислот.

Существует также ряд методик количественного определения. Для определения контаминации пулов плазмы РНК вирусом гепатита C (hepatitis C virus, HCV) адекватными являются испытания, которые могут быть рекомендованы для контроля предельного содержания примесей.

В данном разделе описаны способы валидации только для аналитических методик качественного анализа амплификации нуклеиновых кислот, предназначенных для оценки контаминации пулов плазмы РНК HCV. Для этой цели двумя наиболее важными характеристиками для валидации аналитической методики являются специфичность и предел обнаружения. Кроме того, должна быть оценена устойчивость (робастность) аналитической методики.

Однако данный раздел также может быть использован в качестве основы для валидации всей процедуры амплификации нуклеиновых кислот.

В соответствии с данным разделом за аналитическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детектирования амплифицированного продукта.

При использовании в аналитической методике или ее части коммерческого набора валидацию пользователя можно заменить документированным подтверждением валидации вышеуказанных положений, проведенной производителем набора. Тем не менее пользователем должна быть подтверждена эффективность набора в отношении его предполагаемого использования (то есть предел обнаружения, устойчивость, перекрестная контаминация).

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность представляет собой способность к однозначной оценке наличия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых можно ожидать.

Специфичность аналитических методик, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа конечного продукта) и обоснованности условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и для стадии детектирования).

При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их специфичность в отношении детектирования только РНК HCV путем сравнения выбранной последовательности нуклеотидов с последовательностями нуклеотидов, опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5'-некодирующего участка генома HCV, которые консервативны для всех генотипов.

Амплифицированный продукт должен однозначно идентифицироваться одним из методов, например, проведением амплификации с вложенными праймерами (гнездовая ПЦР), испытанием с использованием ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со специфическим зондом.

Для валидации специфичности аналитической методики испытание должно быть проведено в отношении не менее 100 образцов РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть доказано отсутствие реакции.

Способность аналитической методики к обнаружению всех генотипов HCV также зависит от выбора праймеров, зондов и параметров методики. Эта способность должна быть подтверждена с использованием охарактеризованных панелей сравнения. Однако ввиду сложности получения некоторых генотипов (например, генотипа 6) должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы преобладающих типов (например, в Европе - генотипы 1 и 3).

ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТОДИКИ

За предел обнаружения данной аналитической методики принимают наименьшее количество нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детектировано, но не обязательно определено как точное значение.

Аналитическая методика амплификации нуклеиновых кислот, используемая для детектирования РНК HCV в пулах плазмы, как правило, дает неколичественные результаты (либо положительный, либо отрицательный). Рекомендуется определение предела обнаружения, но в практических целях для аналитической методики на основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено наименьшее положительное значение. Наименьшее положительное значение (в соответствии с определением, приведенным в данной общей фармакопейной статье) представляет собой минимальное количество целевых матричных нуклеиновых кислот в испытуемом объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. Минимальное положительное значение зависит от распределения вирусных геномов в индивидуальных испытуемых образцах и такого фактора, как эффективность фермента, что может привести к получению различных наименьших положительных значений для отдельных испытаний.

Для определения наименьшего положительного значения ряд разведений стандартного образца предприятия или СО ФЕАЭС вируса гепатита C, калиброванного по международному стандартному образцу HCV Всемирной организации здравоохранения, должен быть подвергнут испытанию в разные дни для проверки вариабельности результатов анализа. Для проведения статистического анализа результатов должно быть испытано не менее трех независимых рядов разведений в достаточном количестве повторностей для получения 24 результатов испытания для каждого разведения.

Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведений в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разведений не было слишком большим, следует провести предварительное испытание (например, с использованием логарифмических разведений образца пула плазмы) с получением предварительного наименьшего положительного значения (то есть наибольшего разведения, дающего положительный результат). После этого диапазон разведений может быть выбран в области полученного предварительного значения (с использованием, например, логарифмического фактора разведения 0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концентрацию РНК HCV, которая может быть детектирована в 95% испытаний, рассчитывают с использованием соответствующих методов статистической оценки.

Эти результаты также могут служить для оценки изменчивости результатов, получаемых данной аналитической методикой в ходе испытания и в разные дни.

УСТОЙЧИВОСТЬ (РОБАСТНОСТЬ)

Устойчивость (робастность) аналитической методики - мера ее способности выдерживать воздействие незначительных изменений параметров, являющаяся показателем надежности методики при обычном использовании.

Оценка надежности аналитической методики должна проводиться на этапе ее разработки. Устойчивость должна показать надежность аналитической методики с учетом определенных вариаций параметров. Для методов амплификации нуклеиновых кислот небольшие изменения параметров методики могут иметь решающее значение. Однако в ходе разработки устойчивость методики может быть подтверждена небольшим изменением концентраций реактивов (например, магния хлорида, праймеров или нуклеотидов). Для подтверждения устойчивости не менее 20 РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, отобранных случайным образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в 3 раза превышающей заранее определенное наименьшее положительное значение, должны быть испытаны и признаны положительными.

Проблемы с устойчивостью могут возникнуть также в связи с методиками, в которых стадия ультрацентрифугирования предшествует экстракции вирусной РНК. Поэтому для испытания устойчивости таких методик не менее 20 пулов плазмы, содержащих различные уровни РНК HCV, но не содержащих специфических антител к HCV, должны быть испытаны и признаны положительными.

Предотвращение перекрестной контаминации должно быть подтверждено путем точного детектирования панели не менее чем из 20 образцов, попеременно заполненной образцами отрицательных пулов плазмы и отрицательных пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного наименьшего положительного значения или не менее 10⁴ МЕ/мл).

ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИСПЫТАНИЯ

Для таких биологических методов, как амплификация нуклеиновых кислот, существует вероятность возникновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валидацию, так и на интерпретацию результатов. Методики испытаний должны быть четко описаны в виде стандартных операционных процедур, в которых следует указывать:

- способ отбора проб (тип упаковки и др.);

- приготовление мини-пулов (если применимо);

- условия хранения до испытания;

- четкое описание условий испытания, включая меры предосторожности против перекрестной контаминации и деградации вирусной РНК, используемых реактивов и стандартных образцов;

- четкое описание используемого оборудования;

- детальные формулы расчета результатов, включая статистическую обработку.

В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы качества и надежности аналитической методики, когда бы она ни использовалась, может быть рекомендован подходящий образец для контроля хода испытания (например, подходящее разведение СО ФЕАЭС вируса гепатита C или образец плазмы, инфицированной HCV, калиброванный по международному стандартному образцу HCV Всемирной организации здравоохранения).

Квалификация оборудования. Соответствующая программа квалификации монтажа и функционирования должна быть реализована для каждой критически важной части используемого оборудования. После замены критически важного оборудования (например, терморегуляторов) должна быть документально подтверждена функциональность аналитической процедуры путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных образцов пула плазмы, инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, соответствующей ранее определенному наименьшему положительному значению. Все результаты должны быть положительными.

Квалификация аналитика. В отношении каждого аналитика, принимающего участие в испытании, должна действовать соответствующая квалификационная программа.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ДНК ВИРУСА B19 В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ КРОВИ

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Согласно требованиям Фармакопеи Союза пулы плазмы, используемые при производстве определенных продуктов, должны быть проверены на содержание ДНК вируса B19 (B19V) в концентрации не выше допустимой. Для этого предпочтительно использовать методики амплификации с количественным определением нуклеиновых кислот. Наиболее важными характеристиками для валидации таких методик являются: правильность, прецизионность, специфичность, предел количественного определения, линейность и диапазон применения. Кроме того, должна быть оценена устойчивость (робастность) аналитической методики.

В разделе описаны способы валидации методик амплификации нуклеиновых кислот для определения контаминации пулов плазмы ДНК B19V. Однако данный раздел также может быть использован в качестве основы для валидации в целом процедуры амплификации нуклеиновых кислот.

В соответствии с данным разделом за аналитическую методику принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детектирования амплифицированного продукта.

В случае использования в аналитической методике или ее части коммерческого набора валидацию можно заменить документированным подтверждением валидации вышеуказанных характеристик от производителя набора. При этом пользователем должна быть подтверждена эффективность набора в отношении его предполагаемого использования (то есть правильность, прецизионность, диапазон применения, устойчивость).

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Правильность представляет собой близость совпадения между найденным значением и значением, которое определено как условно правильное, либо принято как значение сравнения. Правильность количественного определения зависит от калибровочного графика и отклонений на различных стадиях количественного определения. Хотя рекомендовано определять правильность во всем специфицированном диапазоне, наиболее важно подтвердить правильность в диапазоне около предельного значения концентрации (количество). В случае количественного определения ДНК B19V в пулах плазмы рекомендуется оценивать правильность методики путем количественного определения не менее 5 концентраций (с логарифмическим коэффициентом разведения 0,5) СО ФЕАЭС вирусной ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот или иного стандартного образца, калиброванного в международных единицах по международному стандартному образцу ДНК B19V Всемирной организации здравоохранения в диапазоне рекомендованного на данный момент порогового значения 10,0 МЕ/мкл ДНК B19V (то есть 10⁵ МЕ/мл, 10^4,5 МЕ/мл, 10⁴ МЕ/мл, 10^3,5 МЕ/мл и 10³ МЕ/мл) не менее чем в трех повторностях для каждого разведения. Правильность должна быть документирована для различных концентраций в процентах, определенных в сравнении с известным количеством ДНК B19V. Следует сопоставить технологический уровень соответствующего метода количественного определения, например, с помощью совместных испытаний.

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Прецизионность представляет собой близость совпадения между сериями измерений, полученных в многочисленных испытаниях различных проб одного и того же гомогенного образца. Прецизионность определяется на трех уровнях:

- повторяемость: выражает точность при одних и тех же условиях испытания в течение короткого промежутка времени, оценивается с использованием одной методики количественного определения, с помощью которой трижды испытывают подходящие разведения положительных образцов с ДНК B19V, калиброванных в международных единицах и охватывающих весь диапазон применения методики количественного определения; коэффициент вариации рассчитывают для индивидуальных образцов;

- промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность: выражает внутрилабораторную вариабельность, устанавливается оценкой повторных испытаний (как рутинный количественный анализ) подходящих разведений положительных образцов с ДНК B19V, калиброванных в международных единицах и охватывающих весь диапазон применения методики количественного определения, в различной обстановке (то есть различные дни, различные аналитики, различное оборудование, различные реактивы); коэффициент вариации рассчитывают для индивидуальных образцов;

- воспроизводимость: выражает точность между различными лабораториями (межлабораторная прецизионность), оценивается путем участия в совместных количественных испытаниях на содержание ДНК B19V.