IX. Методы идентификации и количественного определения ГМО с использованием тест-систем

IX. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМО

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМ

9.1. Метод количественного определения генно-инженерно-модифицированной сои и кукурузы с использованием наборов "TaqMan GMO Soy Detection Kit" и "TaqMan GMO Maize Detection Kit":

- наборы реактивов предназначены для количественного определения в пищевых продуктах генно-инженерно-модифицированной кукурузы или сои;

- метод основан на ПЦР в реальном времени;

- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий кукурузы или сои, и участок рекомбинантной ДНК в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;

- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;

- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий сои или кукурузы;

- выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов "ДНК-сорб-С".

9.2. Метод идентификации и количественного определения ГМО с использованием наборов "Ампликвант ГМ соя", "Ампликвант ГМ кукуруза", "АмплиСенс ГМ соя FTR", "АмплиСенс ГМ кукуруза FTR", разработанных ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.

9.2.1. Набор реактивов "Ампликвант ГМ соя":

- предназначен для количественного определения генно-инженерно-модифицированной сои;

- метод основан на ПЦР в реальном времени;

- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий сои, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты, в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;

- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;

- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий сои;

- выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов "ДНК-сорб-С".

9.2.2. Набор реактивов "Ампликвант ГМ кукуруза":

- предназначен для количественного определения генно-инженерно-модифицированной кукурузы;

- метод основан на ПЦР в реальном времени;

- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий кукурузы, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты, в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;

- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;

- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий кукурузы;

- выделение ДНК из стандартных образцов состава из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ (или набора реактивов "ДНК-сорб-С").

9.2.3. Набор реактивов "АмплиСенс ГМ соя FRT":

- предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной сои в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в реальном времени;

- анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке, для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый флуоресцентными красителями зонд;

- в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные для просмотра 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS in Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации эндогенной ДНК, специфичной для всех линий сои;

- выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора реактивов "ДНК-сорб-С".

9.2.4. Набор реактивов "АмплиСенс ГМ кукуруза FRT":

- предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной кукурузы в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в реальном времени;

- анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке, для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый флуоресцентными красителями зонд;

- в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные для промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации эндогенной ДНК, специфичной для всех линий кукурузы;

- выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора реактивов "ДНК-сорб-С".

9.2.5. Выделение ДНК с использованием набора реактивов "ДНК-сорб-С":

- буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 прогреть при 64 °C до полного растворения кристаллов;

- в каждую пробирку внести по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать;

- инкубировать при 64 °C 1 час, периодически встряхивая на вортекс;

- центрифугировать 5 минут при 12000 - 14000 об./мин.;

- отобрать и перенести надосадочную жидкость в объеме 200 - 350 мкл в чистые пробирки;

- центрифугировать 5 секунд при 5000 об./мин.;

- тщательно ресуспендировать сорбент на вортекс, в каждую пробирку добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешать на вортекс, оставить в штативе на 10 - 15 минут, перемешивая каждые 2 минуты;

- центрифугировать 1 минуту при 5000 об./мин., удалить супернатант;

- добавить по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1 минуту 5000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- добавить по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1 минуту при 10000 - 12000 об./мин., отобрать супернатант;

- повторить процедуру отмывки, отобрать супернатант полностью, поместить пробирки в термостат 64 °C на 5 - 10 минут для подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты;

- добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешать на вортекс;

- поместить в термостат 64 °C на 5 - 8 минут, периодически встряхивая на вортекс;

- центрифугировать 1 минуту при 12000 - 14000 об./мин.;

- раствор ДНК хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °C и в течение 1 года - при температуре минус 20 °C.

9.3. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863, разработанные Центром "Биоинженерия" РАН.

9.3.1. Наборы реактивов для количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863 методом ПЦР в реальном времени:

- в состав каждого набора входят 2 пробирки матричной реакционной смеси, 1 пробирка с термостабильной полимеразой, 8 пробирок со стандартными разведениями рекомбинантной ДНК;

- реакционная смесь на одну пробу содержит 9,25 мкл матричной реакционной смеси, 0,75 мкл термостабильной полимеразы, 32,0 мкл деионизированной воды, конечный объем каждой пробы - 50 мкл;

- реакционную смесь разлить в пробирки по 42 мкл на пробу;

- добавить 8 мкл раствора ДНК в следующем порядке - контроль без ДНК, ДНК 0%, ГМО 0,5%, ГМО 100%, исследуемые образцы;

- центрифугировать;

- условия амплификации: 94 °C - 9 мин. - 1 цикл (94 °C - 30 сек.) + (62 °C - 30 сек.) + (72 °C - 1 мин.) - 40 циклов;

- наборы реактивов оптимизированы для работы на амплификаторах типа ABI Prism 7000/7700.

9.3.2. Метод выделения ДНК с применением технологии Wizard, Promega:

- навеску исследуемого продукта массой 100 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить 300 мкл - буфера I (50 мМ Трис HCl, pH - 8,0; 10 мМ ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы свободной от ДНКаз, 3 М гуанидин тиоцианата) при комнатной температуре;

- растереть пробу в пробирке пестиком до гомогенного состояния;

- добавить 400 мкл буфера II (2% додецилсульфат натрия, 0,2 М NaOH) и перемешать на вортекс;

- инкубировать при 65 °C 30 минут, перемешать на вортекс, охладить до комнатной температуры;

- добавить 400 мкл буфера III (5 М ацетат калия, pH 4,5), перемешать на вортекс 2 минуты;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- надосадок отобрать и перенести в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, добавить смолу Wizard MaxiPreps из расчета 100 мкл смолы на 200 мкл надосадочной жидкости и перемешать на вортекс;

- при помощи стерильного шприца емкостью 2 мл прокачать смесь через микроцентрифужную колонку;

- стерильным шприцом емкостью 2 мл прокачать через микроцентрифужную колонку 2 мл промывочного буфера (0,2 М NaCl, 20 мМ Трис HCl, pH - 8,0, 5 мМ ЭДТА смешать в соотношении 5:7 с 96% этанолом);

- поместить микроколонку в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- центрифугировать 1 минуту при 13000 об./мин.;

- поместить микроколонку в чистую микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить в колонку 100 мкл деионизированной воды, нагретой до 65 °C, центрифугировать 15 секунд при 13000 об./мин.;

- измерить концентрацию раствора ДНК и довести ее до 10 нг/мкл;

- раствор ДНК хранить при минус 20 °C.

9.4. Количественное определение сои линии 40-3-2, кукурузы линий GA 21, MON 810, T-25, Bt-176, Bt-11 с использованием наборов реагентов GeneScan Analytics GmbH.

- используется реакционная смесь, позволяющая амплифицировать участок эндогенной ДНК, характерной для кукурузы или сои, и реакционная смесь, позволяющая амплифицировать участок рекомбинантной ДНК;

- каждая реакционная смесь содержит соответствующие праймеры и зонд, меченный флуоресцентным красителем FAM, специфичный для ГМО и VIC, специфичный для сои или кукурузы;

- интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением программного обеспечения приборов.

9.4.2. Метод выделения ДНК с помощью набора реагентов "GENESpin":

- набор "GENESpin" предназначен для выделения геномной ДНК из пищевых продуктов;

- исследуемый образец пищевого продукта гомогенизировать, добавить лизируюший буфер, содержащий денатурирующие агенты и детергенты;

- лизат центрифугировать;

- добавить связывающий буфер и этанол для создания оптимальных условий осаждения ДНК на фильтре со специально подобранным силикагелем;

- промыть буфером для удаления потенциальных ингибиторов ДНК-полимеразы;

- ДНК элюировать водой или буфером, хранить при минус 20 °C.

9.5. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии MON 810, разработанные ГУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН:

9.5.1. Принцип методов:

- для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке, одна реакция позволяет обнаруживать ДНК сои или кукурузы, другая - последовательность, специфичную для сои линии 40-3-2 или кукурузы линии MON 810;

- для обнаружения ДНК сои или кукурузы используется зонд, меченый красителем R6G, для обнаружения генетической конструкции - красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора;

- интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа АНК-32, ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением программного обеспечения приборов;

- определение процентного содержания ГМО осуществляется с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0%) и ДНК ГМО (100%) в определенном процентном соотношении, разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых пробах.

9.5.2. Метод выделения ДНК "Сорб-ГМО":

- измельченные навески образцов перенести в одноразовые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл;

- внести в каждую пробирку по 600 мкл лизирующего буфера и 10 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать;

- инкубировать 50 - 60 минут при 65 °C, периодически перемешивая на вортекс;

- внести в каждую пробирку по 500 мкл хлороформа, интенсивно перемешать, центрифугировать 10 минут при 12 000 - 14 000 об./мин.;

- верхнюю водную фазу в объеме 300 мкл аккуратно, не захватывая хлороформ и межфазный слой, перенести в пробирку с сорбентом, интенсивно перемешать на вортекс до полного ресуспензирования сорбента, инкубировать при комнатной температуре 10 минут, периодически встряхивая;

- центрифугировать суспензию при 10 000 об./мин. 1 минуту, удалить супернатант;

- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора А, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента, инкубировать при комнатной температуре 2 - 3 минуты, периодически встряхивая;

- центрифугировать при 7 000 об./мин. 30 секунд, удалить супернатант;

- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора Б, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;

- центрифугировать суспензию при 7 000 об./мин. 30 секунд, удалить супернатант;

- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора В, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;

- центрифугировать при 7 000 об./мин. 30 секунд, удалить супернатант;

- поместить пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре 65 °C на 5 минут для испарения жидкости;

- к сухому осадку добавить 100 мкл ТЕ буфера, перемешать на вортекс, инкубировать 10 минут при температуре 65 °C, перемешивая каждые 2 минуты;

- центрифугировать при 12 000 - 14 000 об./мин. 2 минуты;

- чистую надосадочную жидкость перенести в чистую пробирку объемом 0,5 - 1,5 мл, не захватывая сорбент.

9.5.3. Порядок проведения исследований:

- взять необходимое количество пробирок с реакционной смесью из тест-системы из расчета N + 8, где N - количество анализируемых образцов;

- после размораживания реакционной смеси центрифугировать пробирки 30 - 60 секунд при более 4000 об./мин.;

- внести в пробирки по 2 мкл исследуемых образцов и в последнюю очередь калибровочных образцов сои или кукурузы в двух повторах, перемешать многократным пипетированием, поместить пробирки в амплификатор;

- программа амплификации для сои: 10 мин./95 °C, 20 сек./95 °C, 50 сек./62 °C, съемка 50 циклов, 25 °C - хранение;

- программа амплификации для кукурузы: 10 мин./95 °C, 20 сек./95 °C, 50 сек./60 °C, съемка 50 циклов, 25 °C - хранение.

9.6. Для определения ГМО растительного происхождения допустимо использование тест-систем с техническими характеристиками, аналогичными указанным выше и разрешенными для использования в установленном порядке.