Главная
Документы
VIII. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 30.11.2007 N 80 "О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО" (вместе с "МУ 2.3.2.2306-07. 23.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Медико-биологическая оценка безопасности...

VIII. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

8.1. Метод количественного определения генетически модифицированной сои:

- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;

- анализ проводится по гену лектина, который присутствует в геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий сои;

- праймеры на ген лектина:

1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';

3) 5'-FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';

длина ампликона 81 пара нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3';

5) 5' AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3';

6) 5'-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3';

длина ампликона 82 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤

│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │

│Праймеры 1, 2 │900 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 ммоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 ммоль/л каждого │

│(2,5 ммоль/л каждого) │ │

│Праймер 3 │100 нмоль/л │

│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │

└───────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤

│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │

│Праймеры 4, 5 │900 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 ммоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP│200 ммоль/л каждого │

│(2,5 ммоль/л каждого) │ │

│Праймер 6 │100 нмоль/л │

│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │

└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘

- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной сои;

- условия амплификации:

┌─────────────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│ Стадия │ Программа амплификации │

├─────────────────────┼───────────────────────────────────────────────────┤

│Доамплификационный │2 мин./50 °C │

│период │ │

│Денатурация │10 мин./95 °C │

│Амплификация │15 сек./95 °C, │

│ │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов │45 │

│амплификации │ │

└─────────────────────┴───────────────────────────────────────────────────┘

- результаты исследования, приложение 2.22.

8.2. Метод количественного определения генетически модифицированной кукурузы:

- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;

- анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий, за исключением GA 21;

- праймеры на ген инвертазы кукурузы:

1) 5' CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3';

2) 5' GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3';

3) 5'-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3';

длина ампликона 111 пар нуклеотидов;

- праймеры, на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT G 3';

5) 5' TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3';

6) 5'-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3';

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │

│Праймеры 1, 2 │900 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 ммоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, │200 ммоль/л каждого │

│dGTP (2,5 ммоль/л каждого) │ │

│Праймер 3 │100 нмоль/л │

│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │

│Праймеры 4, 5 │900 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 ммоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, │200 ммоль/л каждого │

│dGTP (2,5 ммоль/л каждого) │ │

│Праймер 6 │100 нмоль/л │

│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │

- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация │10 мин./95 °C │

│Амплификация │15 сек./95 °C, 30 сек./60 °C измерение│

│Количество циклов амплификации │50 │

- результат исследований, приложение 2.23.

8.3. Метрологические характеристики метода:

- границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1% до 5%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные отклонения повторяемости результатов (дельта) составляют от 0,067 (для стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО растительного происхождения:

- результаты анализа образцов принимают, если коэффициент корреляции

калибровочной прямой, построенной по сертифицированным стандартным образцам

состава ГМО растительного происхождения, по методу наименьших квадратов

(R ) > 0,97.

8.4. Метод количественного определения сои линии 40-3-2:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;

- используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина, меченные красителями FAM и VIC соответственно;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0%, 2,0%, 1,0%, 0,5% и 0,00%;

- праймеры на ген лектина сои:

1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';

3) 5'-VIC-AAC GGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';

- на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3';

5) 5' GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3';

6) 5'-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР:

┌──────────────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │

│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │18,30 │

│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,10 каждого │

│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,25 каждого │

│Праймеры 3, 6 (10 мкМ) │ 0,50 каждого │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │

│Буфер для ПЦР (10 X) │10,60 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │

│Итого: │50,00 │

└──────────────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.5. Метод количественного определения сои линии A2704-12:

- основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1%, 0,4%, 0,9%, 2,0%; 3,3%;

- праймеры на ген лектина сои:

1) 5' CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3';

2) 5' TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3';

3) 5' FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3';

длина ампликона 105 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3';

5) 5' ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3';

6) 5'-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3';

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │

│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │18,0 │

│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,5 каждого │

│Праймер 3 (10 мкМ) │ 1,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │

│Итого: │50,0 │

└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │

│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │17,0 │

│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 1,0 каждого │

│Праймер 6 (10 мкМ) │ 1,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │

│Итого: │50,0 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.6. Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы (hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты:

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: < 0,02%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%:

- праймеры на ген hmg:

1) 5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3';

2) 5' GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3';

3) 5'-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3';

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3';

5) 5' GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3';

6) 5'-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3';

длина ампликона 92 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │

│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,3 │

│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,1 каждого │

│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,5 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │

│Итого: │50,0 │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │

│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,0 │

│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,25 каждого │

│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,5 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │

│Итого: │50,0 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.7. Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01%, 1,0%, 5,0%, 10,0%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3';

длина ампликона 84 пары нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3';

5) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3';

6) 5'-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3';

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,00 │

│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │

│Праймер 3 (5 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │

│Итого: │50,00 │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,00 │

│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │

│Праймер 6 (5 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │

│Итого: │50,00 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.8. Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,96%, 4,91%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3;

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3';

5) 5' AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3';

6) 5'-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TC-TAMRA-3';

длина ампликона 108 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,00 │

│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │

│Праймер 3 (5 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │

│Итого: │50,00 │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │19,00 │

│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │

│Праймер 6 (5 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │

│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │

│Итого: │50,00 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.9. Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,3%, 0,7%, 1,0%, 1,3%, 2,0%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3';

5) 5' TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3';

6) 5'-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 6,000 │

│количество ДНК 250 нг) │ │

│Деионизированная вода │ 9,000 │

│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,375 каждого │

│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,500 │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,500 каждого │

│(10 млМ) │ │

│dUTP (20 млМ) │ 0,500 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,500 │

│MgCl2 раствор (25 млМ) │ 4,000 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,250 │

│Итого: │25,000 │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 6,0000 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │ 7,7500 │

│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,9375 каждого │

│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,6250 │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,5000 каждого │

│(10 млМ) │ │

│dUTP (20 млМ) │ 0,5000 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,5000 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0000 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,2500 │

│Итого: │25,0000 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.10. Метод количественного определения кукурузы линии T 25:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию T 25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15%, 0,40%, 0,90%, 2,00%, 3,30%:

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3';

5) 5' GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3';

6) 5'-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3';

длина ампликона 102 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │ 9,75 │

│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,50 каждого │

│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,50 каждого │

│(10 млМ) │ │

│dUTP (20 млМ) │ 0,50 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,50 │

│MgCl2 раствор (25 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Итого: │25,00 │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Деионизированная вода │ 8,75 │

│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 1,00 каждого │

│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,50 │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,50 каждого │

│(10 млМ) │ │

│dUTP (20 млМ) │ 0,50 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,50 │

│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Итого: │25,00 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.11. Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,3%, 1,71%, 4,26%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3';

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3';

5) 5' TGG CTC GCG ATC CTC CT 3';

6) 5'-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG T-TAMRA-3';

длина ампликона 112 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │

│количество ДНК 300 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │ 5,00 ммоль/л │

│Праймеры 1, 2 │150,00 нмоль/л каждого │

│dUTP │400,00 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200,00 мкмоль/л каждого │

│Праймер 3 │ 50,00 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 50,00 мкл │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │

│количество ДНК 300 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │ 5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │ 5,00 ммоль/л │

│Праймеры 4, 5 │150,00 нмоль/л каждого │

│dUTP │400,00 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200,00 мкмоль/л каждого │

│Праймер 6 │ 50,00 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 50,00 мкл │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.12. Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM и VIC;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее 0,09%, 0,1%, 0,98%, 9,85%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3';

5) 5' GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3';

6) 5'-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3';

длина ампликона 76 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │

│количество ДНК 250 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │5,00 ммоль/л │

│Праймеры 1, 2 │300 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │

│Праймер 3 │200 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │5,00 ммоль/л │

│Праймер 4 │600 нмоль/л │

│Праймер 5 │300 нмоль/л │

│dUTP │400 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │

│Праймер 6 │200 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │40 │

8.13. Метод количественного определения риса линии LL 62:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса и области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе генома риса и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAМ;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09%, 0,45%, 0,9%, 1,8%, 3,6%;

- праймеры на ген PLD;

1) 5' TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3';

2) 5' CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3';

3) 5'-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3';

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3';

5) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3';

6) 5'-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3';

длина ампликона 88 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК риса:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │5 ммоль/л │

│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │200 нмоль/л каждого │

│dUTP │400 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │

│Праймер 3 (10 мкМ) │200 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │

│количество ДНК 200 нг) │ │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │

│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │

│ │Концентрация в реакционной смеси │

│MgCl2 раствор │5 ммоль/л │

│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │400 нмоль/л │

│dUTP │400 мкмоль/л │

│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │

│Праймер 6 (10 мкМ) │200 нмоль/л │

│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │

│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │

│Амплификация │ │

│Денатурация │15 сек./95 °C │

│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │

│Количество циклов амплификации │45 │

8.14. Метод количественного определения сахарной свеклы линии H7-1:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий сахарной свеклы и области ДНК, специфичной трансформационному событию H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее 0,1%, 0,5%, 0,9%, 2,0%, 5,0%;

- праймеры на ген GS:

1) 5' GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3';

2) 5' GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3';

3) 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3';

длина ампликона 121 пара нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3';

5) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3';

6) 5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3';

длина ампликона 110 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сахарной свеклы:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

Полный текст документа вы можете просмотреть в коммерческой версии КонсультантПлюс.

VII. ПЦР с детекцией результатов методом ферментного анализа на биологическом микрочипе IX. Методы идентификации и количественного определения ГМО с использованием тест-систем