VIII. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
8.1. Метод количественного определения генетически модифицированной сои:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену лектина, который присутствует в геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий сои;
1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';
2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';
3) 5'-FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';
длина ампликона 81 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3';
5) 5' AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3';
6) 5'-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3';
длина ампликона 82 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:
┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 │900 нмоль/л каждого │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 ммоль/л │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 ммоль/л каждого │
│(2,5 ммоль/л каждого) │ │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 │100 нмоль/л │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │
└───────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 │900 нмоль/л каждого │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP│200 ммоль/л каждого │
│(2,5 ммоль/л каждого) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 │100 нмоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной сои;
┌─────────────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├─────────────────────┼───────────────────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный │2 мин./50 °C │
│период │ │
├─────────────────────┼───────────────────────────────────────────────────┤
│Денатурация │10 мин./95 °C │
├─────────────────────┼───────────────────────────────────────────────────┤
│Амплификация │15 сек./95 °C, │
│ │60 сек./60 °C измерение │
├─────────────────────┼───────────────────────────────────────────────────┤
│Количество циклов │45 │
│амплификации │ │
└─────────────────────┴───────────────────────────────────────────────────┘
- результаты исследования, приложение 2.22.
8.2. Метод количественного определения генетически модифицированной кукурузы:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий, за исключением GA 21;
- праймеры на ген инвертазы кукурузы:
1) 5' CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3';
2) 5' GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3';
3) 5'-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3';
длина ампликона 111 пар нуклеотидов;
- праймеры, на целевую последовательность ГМО:
4) 5' CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT G 3';
5) 5' TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3';
6) 5'-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3';
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 │900 нмоль/л каждого │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, │200 ммоль/л каждого │
│dGTP (2,5 ммоль/л каждого) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 │100 нмоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │10,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) │ 5,00 │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│MgCl2 (25 ммоль/л) │ 5 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 │900 нмоль/л каждого │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 ммоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, │200 ммоль/л каждого │
│dGTP (2,5 ммоль/л каждого) │ │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 │100 нмоль/л │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │Довести до 50,00 мкл │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы;
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │15 сек./95 °C, 30 сек./60 °C измерение│
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │50 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
- результат исследований, приложение 2.23.
8.3. Метрологические характеристики метода:
- границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1% до 5%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные отклонения повторяемости результатов (дельта) составляют от 0,067 (для стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО растительного происхождения:
- результаты анализа образцов принимают, если коэффициент корреляции
калибровочной прямой, построенной по сертифицированным стандартным образцам
состава ГМО растительного происхождения, по методу наименьших квадратов
2
(R ) > 0,97.
8.4. Метод количественного определения сои линии 40-3-2:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;
- используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина, меченные красителями FAM и VIC соответственно;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0%, 2,0%, 1,0%, 0,5% и 0,00%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';
2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';
3) 5'-VIC-AAC GGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';
- на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3';
5) 5' GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3';
6) 5'-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3';
- реакционная смесь для проведения ПЦР:
┌──────────────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │
│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │18,30 │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,10 каждого │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,25 каждого │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Праймеры 3, 6 (10 мкМ) │ 0,50 каждого │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР (10 X) │10,60 │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │
├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤
│Итого: │50,00 │
└──────────────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.5. Метод количественного определения сои линии A2704-12:
- основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1%, 0,4%, 0,9%, 2,0%; 3,3%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5' CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3';
2) 5' TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3';
3) 5' FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3';
длина ампликона 105 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3';
5) 5' ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3';
6) 5'-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3';
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │
│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │18,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,5 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (10 мкМ) │ 1,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,0 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │
│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │17,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 1,0 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (10 мкМ) │ 1,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,0 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.6. Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы (hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты:
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: < 0,02%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%:
1) 5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3';
2) 5' GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3';
3) 5'-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3';
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3';
5) 5' GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3';
6) 5'-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3';
длина ампликона 92 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │
│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,3 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,1 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,5 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,0 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,0 │
│количество ДНК 50 - 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,25 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,5 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,6 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,4 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,0 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.7. Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01%, 1,0%, 5,0%, 10,0%;
1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';
2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';
3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3';
длина ампликона 84 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3';
5) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3';
6) 5'-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3';
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (5 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (5 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.8. Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,96%, 4,91%;
1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';
2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';
3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3';
5) 5' AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3';
6) 5'-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TC-TAMRA-3';
длина ампликона 108 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (5 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 4,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │19,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 0,75 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (5 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │10,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │10,60 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,40 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │50,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.9. Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,3%, 0,7%, 1,0%, 1,3%, 2,0%;
1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';
2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';
3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3';
5) 5' TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3';
6) 5'-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3';
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 6,000 │
│количество ДНК 250 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │ 9,000 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (20 мкМ) │ 0,375 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,500 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,500 каждого │
│(10 млМ) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP (20 млМ) │ 0,500 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,500 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (25 млМ) │ 4,000 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,250 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │25,000 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 6,0000 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │ 7,7500 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (20 мкМ) │ 0,9375 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,6250 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,5000 каждого │
│(10 млМ) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP (20 млМ) │ 0,5000 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,5000 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,0000 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,2500 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │25,0000 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.10. Метод количественного определения кукурузы линии T 25:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию T 25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15%, 0,40%, 0,90%, 2,00%, 3,30%:
1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3';
2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';
3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3';
5) 5' GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3';
6) 5'-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3';
длина ампликона 102 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │ 9,75 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │ 0,50 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (10 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,50 каждого │
│(10 млМ) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP (20 млМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (25 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │25,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │ 8,75 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │ 1,00 каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (10 мкМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │ 0,50 каждого │
│(10 млМ) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP (20 млМ) │ 0,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 2,50 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор (50 млМ) │ 4,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Итого: │25,00 │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.11. Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,3%, 1,71%, 4,26%;
1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';
2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';
3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3';
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3';
5) 5' TGG CTC GCG ATC CTC CT 3';
6) 5'-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG T-TAMRA-3';
длина ампликона 112 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │
│количество ДНК 300 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │ 5,00 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 │150,00 нмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400,00 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200,00 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 │ 50,00 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 50,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │ 5,00 │
│количество ДНК 300 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │ 5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │ 5,00 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 │150,00 нмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400,00 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200,00 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 │ 50,00 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 50,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.12. Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM и VIC;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее 0,09%, 0,1%, 0,98%, 9,85%;
1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';
2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';
3) 5'-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3';
5) 5' GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3';
6) 5'-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3';
длина ампликона 76 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │
│количество ДНК 250 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │5,00 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 │300 нмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 │200 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │5,00 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 4 │600 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 5 │300 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 │200 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │40 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.13. Метод количественного определения риса линии LL 62:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса и области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе генома риса и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAМ;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09%, 0,45%, 0,9%, 1,8%, 3,6%;
1) 5' TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3';
2) 5' CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3';
3) 5'-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3';
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3';
5) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3';
6) 5'-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3';
длина ампликона 88 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК риса:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │5 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 1, 2 (10 мкМ) │200 нмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 3 (10 мкМ) │200 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Раствор целевой ДНК (максимальное │5,00 │
│количество ДНК 200 нг) │ │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │0,25 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Буфер для ПЦР 10 X │5,00 │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│ │Концентрация в реакционной смеси │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│MgCl2 раствор │5 ммоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймеры 4, 5 (10 мкМ) │400 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│dUTP │400 мкмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP │200 мкмоль/л каждого │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Праймер 6 (10 мкМ) │200 нмоль/л │
├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤
│Деионизированная вода │довести до 25,00 мкл │
└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘
┌──────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐
│ Стадия │ Программа амплификации │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Доамплификационный период │2 мин./50 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Денатурация первичная │10 мин./95 °C │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Амплификация │ │
│Денатурация │15 сек./95 °C │
│Отжиг │60 сек./60 °C измерение │
├──────────────────────────────────┼──────────────────────────────────────┤
│Количество циклов амплификации │45 │
└──────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────┘
8.14. Метод количественного определения сахарной свеклы линии H7-1:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий сахарной свеклы и области ДНК, специфичной трансформационному событию H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее 0,1%, 0,5%, 0,9%, 2,0%, 5,0%;
1) 5' GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3';
2) 5' GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3';
3) 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3';
длина ампликона 121 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3';
5) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3';
6) 5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3';
длина ампликона 110 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сахарной свеклы:
┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐
- Гражданский кодекс (ГК РФ)
- Жилищный кодекс (ЖК РФ)
- Налоговый кодекс (НК РФ)
- Трудовой кодекс (ТК РФ)
- Уголовный кодекс (УК РФ)
- Бюджетный кодекс (БК РФ)
- Арбитражный процессуальный кодекс
- Конституция РФ
- Земельный кодекс (ЗК РФ)
- Лесной кодекс (ЛК РФ)
- Семейный кодекс (СК РФ)
- Уголовно-исполнительный кодекс
- Уголовно-процессуальный кодекс
- Производственный календарь на 2023 год
- МРОТ 2024
- ФЗ «О банкротстве»
- О защите прав потребителей (ЗОЗПП)
- Об исполнительном производстве
- О персональных данных
- О налогах на имущество физических лиц
- О средствах массовой информации
- Производственный календарь на 2024 год
- Федеральный закон "О полиции" N 3-ФЗ
- Расходы организации ПБУ 10/99
- Минимальный размер оплаты труда (МРОТ)
- Календарь бухгалтера на 2024 год
- Частичная мобилизация: обзор новостей