Таблица 4. Стандартный рацион вивария

Таблица 4

Стандартный рацион вивария

┌──────────────────────────────┬──────────────────────────────────────────┐

│ Ингредиент │ Масса, г на 1 крысу в день │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Крупа овсяная │ 2,5 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Зерновая смесь │ 14,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Хлеб 2 сорт │ 4,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Творог │ 2,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Рыбная мука │ 0,5 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Мясо 2 категория │ 4,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Морковь │ 8,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Зелень │ 8,0 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Рыбий жир │ 0,1 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│Дрожжи │ 0,1 │

├──────────────────────────────┼──────────────────────────────────────────┤

│NaCl │ 0,15 │

├──────────────────────────────┴──────────────────────────────────────────┤

│ Основные нутриенты │

├─────────────────────────────┬───────────────────────────────────────────┤

│Белок │ 3,69 │

├─────────────────────────────┼───────────────────────────────────────────┤

│Жир │ 1,28 │

├─────────────────────────────┼───────────────────────────────────────────┤

│Углеводы │ 12,42 │

├─────────────────────────────┼───────────────────────────────────────────┤

│Энергия, ккал │ 76,0 │

└─────────────────────────────┴───────────────────────────────────────────┘

6.5.2. Исследуемые показатели:

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.

Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием пакетов программ Excel и SPSS 11.5.

6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет).

6.6.1. Схема проведения эксперимента

┌───────────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│Вид животных │ мыши линии С57В1/6 │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Пол │ самцы │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Возраст │ половозрелые │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Исходная масса тела │ 18 - 20 г │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Количество животных в │ не менее 15 особей в каждой группе │

│группе в начале │ │

│эксперимента │ │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Распределение по │Животных делят на 2 группы: │

│группам │ группа "контроль" получает рацион с включением │

│ │ традиционного аналога исследуемого ГМО; │

│ │ группа "опыт" получает рацион с включением │

│ │ исследуемого ГМО │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Рацион <*> │Пищевая и биологическая ценность рациона │

│ │полностью удовлетворяет физиологические │

│ │потребности животных │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Карантин │не менее 7-ми дней │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Условия содержания │Животные получают свободный доступ к корму и │

│ │воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом │

│ │помещении │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Продолжительность │ 30 дней │

│эксперимента │ │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Забор материала для │ На 30-й день эксперимента │

│исследований │ │

└───────────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┘

--------------------------------

<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.

6.6.2. Исследуемые показатели:

1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах.

2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.

Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 "ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.

6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных и включают:

1) изучение влияния на генеративную функцию;

2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий, регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития.

6.7.1. Схема проведения эксперимента

┌───────────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│Вид животных │ крысы линии Вистар │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Пол │ самцы, самки │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Возраст │ 40 - 50 дней │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Исходная масса тела │ 70 - 80 г │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Количество животных в │ не менее 50 особей в каждой группе │

│группе в начале │ /\ │

│эксперимента │ / │

│ │ 30 о, 20 о │

│ │ + │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Распределение по │Животных делят на 2 группы: │

│группам │ группа "контроль" получает рацион с включением │

│ │ традиционного аналога исследуемого ГМО; │

│ │ группа "опыт" получает рацион с включением │

│ │ исследуемого ГМО │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Рацион <*> │Пищевая и биологическая ценность рациона │

│ │полностью удовлетворяет физиологические │

│ │потребности животных │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Карантин │не менее 7-ми дней │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Начало опытного │за 45 - 50 дней перед первым спариванием │

│вскармливания │ │

├───────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│Условия содержания │Животные получают свободный доступ к корму и │

│ │воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом │

│ │помещении │

└───────────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┘

--------------------------------

<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.

6.7.2. Исследуемые показатели:

6.7.2.1. Интегральные показатели

┌────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────┐

│ Изучаемые показатели │ Периодичность сбора данных │

├────────────────────────────────────────────┼────────────────────────────┤

│Общее состояние животных (внешний вид, │ каждые 2 дня │

│двигательная активность, состояние шерстного│ │

│покрова) │ │

├────────────────────────────────────────────┼────────────────────────────┤

│Поедаемость корма │ ежедневно │

├────────────────────────────────────────────┼────────────────────────────┤

│Масса тела │ каждые 7 дней │

└────────────────────────────────────────────┴────────────────────────────┘

6.7.2.2. Показатели, характеризующие генеративную функцию

┌─────────────────────────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Изучаемые показатели │ Сроки сбора данных │

├─────────────────────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│Морфологические исследования семенников │ половозрелые особи │

│(определяют индекс сперматогенеза, среднее │ │

│количество нормальных сперматогоний в каждом │ │

│канальце, относительное количество канальцев с │ │

│12-й стадией мейоза) │ │

├─────────────────────────────────────────────────┤ │

│Морфологические исследования яичников │ │

│(примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и │ │

│более слоями фолликулярных клеток, третичные │ │

│фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее │ │

│количество генеративных форм) │ │

└─────────────────────────────────────────────────┴───────────────────────┘

6.7.2.3. Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства

┌─────────────────────────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Изучаемые показатели │ Сроки сбора данных │

├─────────────────────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│1. Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок │ 19 - 20-й день │

│ на группу │ беременности │

├─────────────────────────────────────────────────┤ │

│2. Визуальное исследование матки, плаценты, │ │

│ плодов: выявление живых и мертвых плодов, │ │

│ подсчет количества желтых тел, мест │ │

│ имплантации, количество резорбций по правому и│ │

│ левому рогу матки (с последующим вычислением │ │

│ пред- и постимплантационной эмбриональной │ │

│ смертности) │ │

├─────────────────────────────────────────────────┤ │

│3. Анализ эмбрионального материала (не менее 5-ти│ │

│ плодов от каждой крысы) │ │

└─────────────────────────────────────────────────┴───────────────────────┘

6.7.2.4. Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства

┌────────────────────────────────────────────────┬────────────────────────┐

│ Изучаемые показатели │ Сроки сбора данных │

├────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│1. Контроль рождения потомства │ 20 - 22-й дни │

│ │ беременности │

├────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│2. Учет величины помета в день родов, подсчет │ 1-й день жизни │

│количества живых и мертвых крысят, подсчет │ │

│особей разного пола, установление внешних │ │

│уродств, измерение массы тела, определение │ │

│краниокаудального размера │ │

├────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│3. Учет показателей физиологического развития │ 1 - 30 дни жизни │

│крысят: срок отлипания ушных раковин, появление │ │

│первичного волосяного покрова, прорезывание │ │

│резцов, открытие глаз, опускание семенников, │ │

│открытие влагалища; выживаемость потомства │ │

├────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│4. Измерение массы тела и роста крысят │ 1, 4, 7, 14, 21 и 25 │

│ │ дни жизни │

└────────────────────────────────────────────────┴────────────────────────┘

6.7.3. Отчет по результатам исследований репродуктивной токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции.