6.4.1. Характеристика тест-объекта

В 70 - 90-е годы исследователями разных стран разработана методология биотестирования с использованием гамет, зародышей и личинок морских ежей - "Sea Urchin Test System". Наиболее широкое применение получил метод, основанный на анализе эмбрионального и раннего личиночного развития морских ежей, - "Sea Urchin Embryo Test" (Kobayashi N., 1984. Marine ecotoxicological testing with Echinoderms // Personne G., Jaspers E., Clans C. (eds.) Ecotoxicological Testing for the Marine Environment. Belgium, Breden: State Univ. Ghent & fast Mar. Sci. Res. V. 1, p. 341 - 405). Его основные преимущества: возможность получения большого количества гамет и синхронно развивающихся зародышей; простота инкубации зародышей и личинок на ранних этапах развития в контролируемых условиях; легкость прижизненных наблюдений и анализа фиксированного материала, поскольку нормальный эмбриогенез морского ежа и отклонения от нормы (аномалии развития) детально описаны; возможность использования разных видов морских ежей, так как чувствительность их половых клеток и зародышей к химическим веществам практически одинакова.

Для получения половых клеток можно использовать морских ежей любого из видов, обитающих в морях России. Это в основном - шаровидные морские ежи стронгилоцентротусы (Strongylocentrotus droebachiensis, S. nudus, S. intermedius), дисковидные морские ежи (Echinaracknius parma, Scaphechinus mirabilis) и ловениды (Echinocardium cordatum).

Морских ежей отлавливают в сезон их размножения, так как только зрелые гонады содержат достаточное количество качественных половых клеток. Для стимуляции нереста применяют инъекцию в превисцеральную полость тела (через перистомальную мембрану) 0,5 см3 0,5 М раствора KCl (на дистиллированной воде). Ежей укладывают аборальной стороной вниз на плоскую поверхность. После начала выделения половых клеток (яйцеклетки имеют желто-оранжевый цвет, сперма - белый) самцов сразу отделяют от самок. Самку следует быстро обмыть сначала пресной водой (чтобы уничтожить случайно попавшие сперматозоиды), затем морской и поместить на высокий узкий стакан объемом 100 - 200 мл, заполненный фильтрованной морской водой таким образом, чтобы аборальный полюс ежей был погружен в воду. Сразу после этого из гонопоров начинают вытекать струйками зрелые яйца, довольно быстро оседающие на дно стаканов. Основная масса яиц вытекает в воду за 15 - 30 минут. Воду из стаканов сливают, заменяют свежей и дают яйцам снова осесть; эту процедуру повторяют 2 - 3 раза. Рекомендуется также профильтровать суспензию яйцеклеток через мельничный газ (размер ячеи 100 x 100 мкм) для освобождения клеток от студенистой оболочки и очистки суспензии от механических примесей. Полученные отмытые яйца желательно сразу же использовать для опыта. В случае необходимости их можно хранить в холодильнике без перемешивания в течение нескольких часов. Партия яйцеклеток не должна содержать недозрелых (ооциты, определяемые по наличию крупного пузырькового ядра) или перезрелых (разрушающихся) клеток.

Сперму следует извлекать из семенников вскрытых самцов и хранить в "сухом" виде в холодильнике или на льду в течение 6 - 12 часов. Перед использованием ее следует разбавить морской водой и таким образом активировать.