6.4.2. Проведение исследований

Предварительно необходимо проверить способность гамет к оплодотворению. Каплю суспензии яйцеклеток помещают на предметное стекло и вносят разбавленную морской водой сперму. Половые клетки считаются качественными, если в течение 3 мин. после осеменения оболочка оплодотворения (отслаивающаяся в результате кортикальной реакции желточная оболочка яйцеклетки) появляется не менее чем у 95% яйцеклеток.

Посуда должна быть стеклянная или нетоксичная пластиковая, однократного использования. Стеклянную посуду следует мыть питьевой содой, без применения мыла и детергентов. Объем инкубационной среды зависит от задач эксперимента, может составлять от 0,3 мл до единиц, десятков и сотен миллилитров.

Яйцеклетки должны быть распределены по дну инкубационной емкости монослоем. Оптимальная концентрация яйцеклеток в среде при проведении экспериментов в течение 48 - 96 часов (время, достаточное до достижения стадии плутеуса у большинства видов морских ежей) не должна превышать 300 кл/см3. Концентрацию яйцеклеток в среде подсчитывают в 3 - 5 аликвотах по 0,01 см3, взятых из взвешенной суспензии яиц, определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию в 1 см3.

В пределах одного эксперимента следует использовать один образец спермы с наиболее подвижными и жизнестойкими сперматозоидами. Необходимо соблюдать определенный порядок внесения гамет в инкубационную среду. Рекомендуется первоначально вносить в инкубационную среду яйцеклетки, а затем - сперматозоиды. В этом случае нет необходимости определять концентрацию сперматозоидов, достаточно лишь соблюдать рекомендации по конечному разведению спермы для того, чтобы избежать полиспермии. Величины конечного разведения спермы в инкубационной среде - от 1:60000 до 1:100000.

Для того чтобы правильно идентифицировать стадии развития зародышей и личинок, определять время их прохождения и отличать нормальных зародышей и личинок от аномалий развития, предварительно следует составить таблицу нормального развития используемого в работе вида морского ежа.

Для различных видов стронгилоцентротусов (Strongylocentrotus droebachiensis, S. Nudus и S. Intermedium) можно использовать уже имеющиеся в литературных источниках таблицы. Все опыты должны проводиться при одинаковой температуре, находящейся в пределах оптимального для каждого вида диапазона, и в оптимальных диапазонах солености (обычно 28 - 32 промилле) и pH (обычно 7,8 - 8,2).

На определенных этапах развития (обычно это оплодотворение, первое деление дробления, средняя бластула, поздняя гаструла и плутеус) часть зародышей и личинок (не менее 100 экземпляров на каждой стадии) отбирают из инкубационной среды и фиксируют слабым раствором (конечная концентрация 0,02 - 0,05%) формальдегида или глутаральдегида на морской воде. При использовании иммунологических планшетов фиксацию следует производить прямо в ячейках. Следует иметь в виду, что наличие фиксатора в близлежащих ячейках оказывает отрицательное влияние на личинок, поэтому фиксацию нужно проводить на каком-нибудь одном (конечном) этапе развития (например, гаструлы или плутеуса). На стадиях оплодотворения, первого деления и средней бластулы зародыши, находящиеся в оболочке оплодотворения, неподвижно лежат на дне, что позволяет вести прижизненное наблюдение и осуществлять необходимые подсчеты с использованием инвертированного микроскопа.

Описание этапов развития морского ежа и типичные аномалии эмбрионального развития приведены в таблицах 6.4.1.а, 6.4.1.б.