7.3.1.3. Проведение исследований

а. Без предварительной травматизации хрусталика глаза. Рыбы выдерживаются в исследуемых концентрациях токсиканта. Возможно проведение подострых и хронических опытов. После экспозиции в растворах вещества рыб забивают декапитацией. У них извлекают глаза, которые помещают в фиксатор из смеси абсолютного этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Глаза могут помещаться в марлевый мешочек с этикеткой на дно банки с фиксатором. Банку на 1/4 заполняют обезвоженным медным купоросом. Продолжительность фиксации 24 ч. После фиксации глаза рыб обрабатываются поочередно.

Глаза из фиксатора перемещают в дистиллированную воду на 20 минут. По мере обводнения они опускаются на дно стакана с водой. После положенного срока поочередно каждый глаз помещают на ладонь вниз роговицей и вверх отверстием зрительного нерва. Глазными ножницами срезают дно глаза так, чтобы в образовавшееся отверстие мог пройти хрусталик. Хрусталик при этом становится видимым, но повернут к препаратору задним полюсом. В задний полюс вводят иглу с трехгранным сечением до упора в ядро хрусталика. Хрусталик изымается из глаза.

Дальнейшие операции сводятся к снятию передней капсулы хрусталика с эпителием и к получению плоскостного препарата из снятой с хрусталика полусферы. Сразу же после изъятия хрусталика из глаза трехгранной иглой, которая не дает возможности ему вращаться по оси, хрусталик перемещают в каплю дистиллированной воды. В этой капле микроскальпелем по экватору хрусталика делают надрез и переднюю капсулу с эпителием помещают с волоконной частью глазной линзы в воду. Наряду с капсулой на предметном стекле в капле воды могут оказаться фрагменты волокон хрусталика, частицы сетчатки и радужной оболочки.

Необходимо подготовить другое предметное стекло с каплей воды, в которую микропинцетом или обычной препаровальной иглой переносят капсулу хрусталика с эпителием.

Далее микроскальпелем наносятся насечки от периферии к центру полусферы капсулы хрусталика. Обычно бывает достаточно 5 - 6 глубоких насечек, чтобы полусферическую переднюю капсулу хрусталика можно было бы уложить в одной плоскости на предметном стекле. Отдельные части капсулы расправляют препаровальной иглой и "микрокочергой". Одновременно удаляют оставшиеся на эпителии волокна хрусталика. После первого расправления вода частично отсасывается фильтровальной бумагой.

Отдельные лепестки капсулы после насечек должны подворачиваться внутрь. Это гарантирует то, что эпителий хрусталика оказывается между стеклом и капсулой. В этом случае плоскостной препарат приклеивается к предметному стеклу при частичном подсушивании.

Дальнейшие операции сводятся к подсушиванию фильтровальной бумагой плоскостного препарата эпителия хрусталика и к частичному выправлению капсулы, она присушивается к стеклу, но не доводится до полного высыхания. Побелевшую, но еще влажную капсулу закрывают каплей красителя (при использовании красителя гемалаун Майера процесс окрашивания длится 5 - 8 мин.). При окраске гемалаун Майера препарат помещают в водопроводную воду, отмывают от красителя и проявляют там до подсинения.

После окраски препарата на предметном стекле его проводят через спирты, доводят до ксилола и заключают в канадский бальзам или в другую синтетическую среду.

Подсчет хромосомных аберраций проводят по методике, описанной на стадиях ана-телофазы в клетках эпителия как для всего хрусталика, так и для отдельных зон цитодифференцировки эпителия: центральной, герминативной и предэкваториальной. Высокая митотическая активность в герминативной и предэкваториальной зонах позволяет более полно выявить хромосомные мутации по сравнению с исследованием на других тканях.

б) Исследование с предварительной травматизацией хрусталика. Рыбы после экспозиции в растворах токсикантов за двое суток до приготовления препаратов эпителия хрусталика подвергаются травматизации уколом. Укол наносят тонкой энтомологической иглой в передний полюс хрусталика на 1/5 его диаметра. В первые сутки травматизацией гасятся спонтанные митозы в эпителии хрусталика, а затем появляются синхронизированные посттравматические митозы, полоса которых повторяет конфигурацию травмы. Таким образом, хромосомные аберрации на стадии ана-телофазы подсчитываются в посттравматических, синхронизированных митозах. Приемы подготовки препаратов эпителия хрусталика не отличаются от вышеописанных.