6.1.3. Определение диастазного числа

Диастазное число характеризует активность амилолитических ферментов меда.

Метод основан на колориметрическом определении количества субстрата, расщепленного в условиях проведения ферментативной реакции, и последующем вычислении диастазного числа.

Диастазное число выражают количеством кубических сантиметров раствора крахмала массовой долей 1%, которое разлагается за 1 ч амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 г безводного вещества меда. 1 куб. см раствора крахмала соответствует 1 единице активности.

Аппаратура, материалы, реактивы. Фотоэлектроколориметр; pH-метр; электрод измерительный стеклянный; баня-термостат водяная на 20 и 40 °C; пробирки стеклянные диаметром 20 мм и высотой 200 мм; бюретка вместимостью 25 куб. см с ценой деления 0,1 куб. см; пипетки вместимостью 1, 2 и 5 куб. см; колбы мерные вместимостью 50 куб. см; секундомер; крахмал растворимый для йодометрии, раствор массовой долей 0,25%; кислота уксусная ледяная плотностью 1,07 г/куб. см, раствор концентрации 0,2 моль/куб. дм; ацетат натрия трехводный, раствор концентрации 0,2 моль/куб. дм; хлорид натрия, раствор концентрации 0,1 моль/куб. дм; 2,4-динитрофенол; йод, раствор концентрации 0,25 моль/куб. дм; раствор буферный стандартный с pH, близким к 5,0, для проверки стеклянного электрода; вода дистиллированная.

Подготовка к испытанию. Ацетатный буферный раствор концентрации 0,2 моль/куб. дм с pH 5,0 приготовляют, смешивая одну объемную часть раствора уксусной кислоты и три объемных части раствора ацетата натрия. В полученном буферном растворе растворяют 2,4-динитрофенол с таким расчетом, чтобы его концентрация в комбинированном реактиве составила 0,05%. Проверяют pH раствора потенциометрически и в случае отклонений от pH 5,0 его корректируют, добавляя раствор уксусной кислоты 0,3 моль/куб. дм или раствор ацетата натрия концентрации 0,2 моль/куб. дм.

Комбинированный реактив готовят из восьми объемных частей раствора крахмала, пяти объемных частей буферного раствора с 2,4-динитрофенолом и одной объемной части раствора хлорида натрия. При приготовлении комбинированного реактива в количестве, равном или большем 1 куб. дм, объем соответствующих растворов отмеривают с точностью до 0,5 куб. см. Полученную смесь тщательно встряхивают. Реактивы хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

Раствор меда. 5 г меда, взвешенного с точностью до 0,01 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 50 куб. см. 1 куб. см такого раствора содержит 0,1 г меда.

Раствор крахмала. 0,25 г крахмала, взвешенного с точностью до 0,001 г, размешивают в стаканчике вместимостью 50 куб. см с 10 - 20 куб. см дистиллированной воды и количественно переносят в коническую колбу, где не сильно кипит 80 - 90 куб. см дистиллированной воды. Кипение продолжают 2 - 3 мин. Колбу охлаждают до 20 °C, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки.

Проведение испытания. В сухую пробирку отмеривают из бюретки 14 куб. см комбинированного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают на 10 мин. в водяную баню с температурой 40 °C. Затем в пробирку вносят пипеткой 1 куб. см раствора меда. Содержимое перемешивают пятикратным перевертыванием, и пробирку вновь помещают на водяную баню, одновременно включая секундомер. Пробирку выдерживают на водяной бане в течение 15 мин. при температуре (40 +/- 0,02) °C.

Пипеткой отбирают 2 куб. см реакционной смеси, которую вносят при перемешивании в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, содержащую 40 куб. см воды и 1 куб. см раствора йода, имеющих температуру 20 °C. Раствор доводят водой до метки. Колбу закрывают пробкой, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают на водяной бане при 20 °C в течение 10 мин.

Одновременно проводят контрольный опыт, заменяя раствор меда дистиллированной водой.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допустимые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 0,6 ед. Готе в интервале величин менее 10 ед.